抑制青霉菌乳酸菌的分離、鑒定及抑菌物質分析

李 院，魏新元，王 靜，丁 武，鄭方圓，胡先苗，寇莉萍

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

抑制青霉菌乳酸菌的分離、鑒定及抑菌物質分析

李 院，魏新元*，王 靜，丁 武，鄭方圓，胡先苗，寇莉萍*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

目的：從市售醬菜中篩選具有抑制青霉菌活性的乳酸菌，測定其對醬菜中主要霉菌及產毒真菌的抑菌效果，分析乳酸菌抑制青霉菌的有效成分，并對乳酸菌進行分子生物學鑒定。方法：采用雙層平板法對醬菜中具有抑制青霉菌活性的乳酸菌進行篩選，打孔法測定其抑制青霉菌作用，并采用蛋白酶消化、調節(jié)pH值、熱處理等方法分析抑菌物質的有效成分，采用16S rDNA聚合酶鏈式反應擴增后測序對乳酸菌進行鑒定。結果：從醬菜中篩選出的14 株乳酸菌中，其中3 株對醬菜中分離的青霉菌及2 株產毒真菌的生長有較明顯的抑制作用，不同蛋白酶處理、pH值調節(jié)對乳酸菌發(fā)酵濃縮液的抑菌活性會有不同影響，但是3 種加熱處理并不改變抑菌效果。3 株乳酸菌經鑒定分別為：彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。結論：從醬菜中分離的乳酸菌對醬菜中青霉菌及某些產毒霉菌的生長有明顯抑制作用，推測其抑菌成分可能為小分子肽和/或有機酸。

醬菜；乳酸菌；霉菌；抑菌物質；抑制活性

醬菜是中國民間常見的佐飯小菜，擁有悠久的歷史，深受廣大人民群眾的喜愛。醬菜隨吃隨取，方便實用，配粥，配面食，甚至米飯、零食也皆可配食。通常先將洗凈晾干的蔬菜進行腌制后再洗凈控干，然后加入醬料并配以香辛料，最后拌油即成醬菜[1]。醬菜水分含量較高，在生產、加工及貯存過程中極易受到各種微生物的污染，從而導致蔬菜變色、變味、腐敗變質，有些霉菌還可能產生真菌毒素引起食物中毒[2-3]?，F(xiàn)在通常采用鹽漬和添加防腐劑延長醬菜保質期，但高鹽和防腐劑容易對人體造成傷害。制作低鹽化及低防腐劑的醬菜，既保持其固有的品質，又能延長其貨架期，是蔬菜腌制品行業(yè)發(fā)展的新課題和發(fā)展趨勢。

乳酸菌是當前廣泛應用于食品行業(yè)中的被普遍認為安全（general regard safety，GRS）的一類微生物。近幾年來，乳酸菌對一些腐敗菌和致病菌的抑制作用研究引起人們極大的關注，相關抑菌機制也得到闡明[4-9]。目前，多種發(fā)酵食品中乳酸菌的抑菌作用已被證實[10-12]，但關于醬菜是否存在乳酸菌及其抑菌作用鮮有報道，因此，本研究擬從醬菜中篩選對其分離出的污染霉菌具有明顯抑制作用的乳酸菌，對其抑菌成分進行分析，并對乳酸菌進行分子生物學鑒定，以期為延長低鹽及低防腐劑醬菜的保質期提供生物防腐資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與菌種

醬菜制品：包括醬制黃瓜、白蘿卜條、海白菜、大蒜、辣椒醬、芥菜絲，共6 種，購于超市和市場，6 種醬菜均為非發(fā)酵型醬菜。

菌種：從醬菜制品分離獲得的乳酸菌和霉菌；赭曲霉（TCCC41060）、黃曲霉（CGMCC3.2890） 西北農林科技大學食品科學與工程學院微生物發(fā)酵與工程實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：乳酸菌篩選使用添加2 g/L碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，乳酸菌培養(yǎng)使用MRS培養(yǎng)基，霉菌篩選使用馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)選用PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

溶菌酶、蛋白酶K、酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混合液等 北京索萊寶科技有限公司；rTaq酶 大連寶生物工程有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA凝膠回收試劑盒 杭州愛思進生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醬菜中乳酸菌和霉菌的分離與純化

1.2.1.1 醬菜中乳酸菌的分離與純化

將6 種醬菜樣品無菌操作各稱取鮮質量10 g，切成5 mm小丁，加入90 mL無菌生理鹽水渦旋振蕩3 min，然后取懸浮液進行梯度稀釋至10－7，接著分別從10－4～10－7稀釋度吸取1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，倒入50 ℃的含有碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基15～20 mL混勻后冷卻至室溫，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。挑取有溶鈣圈的菌落繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基上進行分離純化[13]。將產生溶鈣圈的菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，染色陽性且過氧化氫酶陰性菌株初步定為乳酸菌[14]。甘油冷凍保藏。

1.2.1.2 醬菜中霉菌的分離與純化

從以上用于乳酸菌分離的樣品系列稀釋液的10－2～10－5稀釋度分別吸取200 μL菌懸液涂布于馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基表面。置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取少許霉菌所產孢子到PDA平板上進行劃線分離、純化[15]。

1.2.2 霉菌鑒定

純化的霉菌單菌落生長3～5 d后，待其產孢，用接種環(huán)挑取少量孢子點于PDA平板中心，在28 ℃連續(xù)培養(yǎng)3～5 d后觀察菌落形態(tài)，生長緩慢的真菌培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)。然后進行顯微形態(tài)觀察，在載玻片上加1 滴乳酸石碳酸棉蘭，挑取少量帶孢子的菌絲，壓片后顯微鏡下觀察菌體菌絲形態(tài)[16]。挑選具有不同群體和個體形態(tài)特征的霉菌孢子進行保藏備用。

1.2.3 具抑制霉菌活性的乳酸菌初步篩選

1.2.3.1 霉菌孢子液的制備

選取霉菌分離實驗中最常見的菌株——青霉菌作為乳酸菌抑制作用檢測的測試菌，將待試青霉菌菌株接種在PDA斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d左右至大量孢子產生，加入5 mL滅菌生理鹽水于斜面試管，渦旋振蕩5 min，采用400 目無菌紗布過濾除去營養(yǎng)菌絲體[17-18]，收集的孢子懸液使用血球計數(shù)板計數(shù)，備用。

1.2.3.2 具有抑制青霉菌活性乳酸菌的篩選

使用雙層平板法篩選對霉菌具有抑制活性的乳酸菌[19]。首先將固體MRS培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿作為下層平板，待其凝固后，用接種環(huán)沾取生長至對數(shù)期的乳酸菌在平板上劃兩條長2 cm的平行直線，于37 ℃培養(yǎng)24 h，至長出菌苔。然后將含有孢子濃度為5×104個/mL的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，覆蓋在含乳酸菌菌苔的下層培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)72 h，檢測乳酸菌生長條帶周圍是否出現(xiàn)抑菌圈。挑選具有抑菌效果的乳酸菌進行后期實驗。

1.2.4 乳酸菌對醬菜中污染霉菌的抑制作用

1.2.4.1 無菌濃縮乳酸菌發(fā)酵液的制備

將乳酸菌以1%接種量接種，在37 ℃培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液在冷凍離心機中以3 000 r/min的轉速離心12 min，取其上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除去菌體，置于－80 ℃冰箱中冷凍12 h，經過真空冷凍干燥機濃縮，制備成10 倍濃縮液。

1.2.4.2 濃縮液抑制霉菌活性測定

采用打孔法測定抑菌活性[20]。用2.0 g/100 mL素瓊脂作下層平板，在上層傾入孢子濃度為5×104個/mL的PDA培養(yǎng)基，待其凝固后，用直徑為6 mm的無菌打孔器打孔，滴加2 滴素瓊脂封底，稍后加入60 μL濃縮液，以10 倍濃縮MRS液體培養(yǎng)基為對照。28 ℃培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈直徑，檢測濃縮液的抑霉菌活性。為了進一步檢測乳酸菌濃縮液的抑霉菌活性，本實驗對赭曲霉和黃曲霉也進行了抑菌測試。

1.2.5 乳酸菌抑制青霉菌有效成分分析

為了分析乳酸菌發(fā)酵濃縮液對青霉菌起抑制作用的有效成分，本實驗通過蛋白酶處理實驗，pH值調節(jié)實驗和溫度處理實驗對3 株乳酸菌抑青霉菌的活性成分進行了分析。

1.2.5.1 蛋白酶處理對濃縮液抑制霉菌活性的影響

分別向濃縮液中加入終質量濃度為1 mg/mL的不同蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K），于37 ℃水浴2 h后取出，80 ℃水浴處理2 min使酶失活。采用打孔法檢測蛋白酶處理后濃縮液的霉菌抑制活性，以未使用蛋白酶處理的濃縮液作為對照。

1.2.5.2 發(fā)酵液中有機酸對濃縮液抑制青霉菌活性的影響

用1 mol/L NaOH分別調節(jié)濃縮液pH值至4.0、5.0、6.0，采用打孔法測定處理后的濃縮液對霉菌的抑制作用，以未經調整pH值的濃縮液作為對照。

1.2.5.3 熱處理對濃縮液抑制青霉菌活性的影響

將濃縮液置于60、80、100 ℃水浴中處理5 min，打孔法測定處理后的濃縮液對霉菌的抑制作用，檢測抑菌物質熱穩(wěn)定性，以未處理的濃縮液為對照。

1.2.6 乳酸菌菌株的鑒定

1.2.6.1 DNA的提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取乳酸菌的基因組DNA[21]。

1.2.6.2 乳酸菌16S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增與測序

以乳酸菌菌株基因組DNA為模板，利用擴增細菌16S rDNA的通用引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1495r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’），對乳酸菌的16S rDNA進行PCR擴增[22]。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；然后94 ℃變性45 s、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[23-24]。PCR產物大小經過瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后，將目標條帶進行純化，然后送北京英俊生物工程有限公司進行測序。

1.2.6.3 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

采用核酸BLAST技術，將測序獲得的序列信息與美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網站里的GenBank數(shù)據(jù)庫進行對比，找到與所測序列同源性最高的已知分類地位的菌種。然后從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中獲得已知菌株的16S rDNA基因序列，與所測菌株的16S rDNA序列一起，采用MegAlign（Clustal w）進行比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株分類地位。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與純化

通過采用含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基對醬菜中的優(yōu)勢乳酸菌進行分離，經過48 h培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)10－4稀釋度的醬白蘿卜和醬黃瓜中分別有10 個和4 個能產生溶鈣圈的菌落，而其他4 種醬菜中沒有出現(xiàn)產生溶鈣圈的菌落。然后將以上14 個單菌落繼續(xù)使用改良MRS平板進行劃線分離純化，獲得純化的乳酸菌疑似菌株。對14 株疑似乳酸菌進行編號，白蘿卜醬菜中分離到的乳酸菌編號為：L511～L520，對醬黃瓜中分離得到的乳酸菌編碼為：L541～L544。

2.2 霉菌的分離、純化與初步鑒定

為了確定醬菜中主要的污染霉菌，本研究使用馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基對醬菜稀釋液中的霉菌進行分離，發(fā)現(xiàn)2 d后從醬海白菜、醬芥菜、醬紅辣椒和醬大蒜的10－2稀釋度菌懸液對應的平板上能長出霉菌菌落，5 d后產生有色孢子，而醬白蘿卜和醬黃瓜中未能分離到霉菌菌落。將以上霉菌孢子及菌絲體生長特征相近的菌落數(shù)較多的一類或者兩類霉菌挑出來進行進一步分離、純化，純化霉菌進行孢子懸液保藏，備用。然后對霉菌進行菌落特征及個體形態(tài)顯微特征觀察，初步確定其分類地位[25]。結果見圖1及表1，本實驗從醬菜中分離到的霉菌包括青霉、木霉、曲霉和根霉，其中青霉最為常見。

圖1 霉菌顯微特征觀察（×400）Fig.1 Morphology of molds under microscope (×400)

表1 霉菌的菌落形態(tài)及顯微觀察Table 1 Colony morphology and microscopic morphology of contaminating molds in pickles

2.3 具有霉菌抑制活性乳酸菌的初步篩選

在對霉菌具有抑制活性的乳酸菌的篩選中，本實驗使用從醬菜中分離的最常見的青霉菌作為測試菌，采用雙層平板法對所分離到的14 株乳酸菌菌株進行初步篩選，檢測其對霉菌的抑制效果，結果發(fā)現(xiàn)，其中3 株菌（分別為L511、L520、L544）對青霉具有明顯的抑制作用（圖2，以L544為例），而其他11 株菌抑制作用或者很差，或者根本沒有抑制效果呈現(xiàn)。

圖2 乳酸菌L544對青霉的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of lactic acid bacterium L544 on Penicillium

2.4 乳酸菌對醬菜中霉菌及常見真菌毒素產生菌的抑菌譜

本研究進一步檢測了乳酸菌對醬菜中分離的霉菌和實驗室保存的其他兩種產真菌毒素霉菌——赭曲霉和黃曲霉的抑制效果，結果見表2。

表2 乳酸菌發(fā)酵液對醬菜中霉菌及常見產毒真菌的抑菌譜Table 2 Antimicrobial spectra of LAB culture supernatants to molds isolated from pickles and common toxigenic fungi

由表2可知，醬菜中的分離得到的3 株乳酸菌對醬菜中的多種霉菌均有較明顯的抑菌效果，對青霉屬F1及曲霉屬F3的抑菌效果最好，抑菌圈直徑均大于18 mm，木霉屬F2的抑菌圈直徑在6～18 mm之間，根霉屬F4的抑菌圈直徑大于12 mm。此外，3 株乳酸菌對食品中常見產毒霉菌也體現(xiàn)了較強的抑菌作用，在對黃曲霉的抑菌實驗中，3 株乳酸菌作用的抑菌圈直徑均在6～18 mm之間，而乳酸菌L520及L544對赭曲霉作用的抑菌圈直徑均大于18 mm。

2.5 乳酸菌抑制青霉菌有效成分分析

本研究通過蛋白酶處理法、pH值調節(jié)法、高溫處理法對乳酸菌抑制青霉菌的可能有效成分進行了分析，表3為乳酸菌濃縮液經過不同處理后的抑菌效果。

表3 不同處理方法對乳酸菌發(fā)酵濃縮液抑制青霉菌活性的影響Table 3 Effect of different treatments on the antimicrobial activity of concentrated LAB culture supernatants against Penicillium

由表3可知，3 株乳酸菌的發(fā)酵濃縮液經不同方法處理后其抑菌活性有不同程度的變化。在蛋白酶處理實驗中，發(fā)酵濃縮液在經過胃蛋白酶及胰蛋白酶處理后抑菌活性沒有改變，而它們均對蛋白酶K有一定的敏感度，與L520相比，L511與L544對蛋白酶K更為敏感。由于蛋白酶K屬于切割性較廣的高活性蛋白酶，與胃蛋白酶與胰蛋白酶相比，其作用的肽鍵范圍更廣，因此推測，上述3 株乳酸菌發(fā)酵濃縮液中的抑菌活性物質包含有蛋白質或者肽類物質。

由表3可知，在對乳酸菌發(fā)酵濃縮液的pH值調節(jié)實驗中，當發(fā)酵濃縮液pH值調整為4.0時，L511的抑菌活性會受到一定影響（抑菌圈直徑范圍為（12 mm，18 mm]），但對L520、L544的抑菌活性幾乎沒有影響；當pH值調整為5.0時，L511抑菌活性消失，L520、L544的抑菌活性也受到較大影響（抑菌圈直徑范圍為（6 mm，12 mm]）；而當pH值調整為6.0時，3 株乳酸菌發(fā)酵濃縮液的抑菌活性均消失。由此可知，乳酸菌發(fā)酵濃縮液的抑菌活性受pH值變化的影響較大。

在對濃縮液的熱處理實驗過程中，濃縮液在經過60、80、100 ℃水浴處理5 min后其抑菌活性幾乎不受影響（抑菌圈直徑＞18 mm）。由此推測，3 株乳酸菌發(fā)酵濃縮液中的抑菌物質熱穩(wěn)定性較高。

2.6 16S rDNA序列同源性分析

2.6.1 PCR反應產物的檢測及序列測定

用1%的瓊脂糖凝膠對菌株L511、L520、L544的16S rDNA擴增產物電泳檢測，經溴乙錠染色后，均在1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶（圖3），與預期結果一致。

圖3 菌株L511、L520、L544的16S rDNA基因擴增電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of 16S rDNA from strains L511, L520 and L544

2.6.2 乳酸菌的鑒定

圖4 菌株L511、L520、L544根據(jù)16S rDNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains L511, L520 and L544 constructed based on 16S rDNA sequence analysis

將具有青霉菌抑制活性的乳酸菌株的16S rDNA的PCR產物測序后，進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株的分類地位，結果見圖4。所測序列輸入GenBank與數(shù)據(jù)庫進行比對，結果表明菌株L511的16S rDNA基因序列與彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）LA3有99%同源性，L520與清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）28-3有高于99%的同源性，而L544與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）PLD1的同源性超過99%。依據(jù)16S rDNA基因序列的同源性分析，確定菌株L511為彎曲乳桿菌（L. curvatus），菌株L520為清酒乳桿菌（L. sakei），菌株L544為植物乳桿菌（L. plantarum）。

3 結論與討論

本研究從不同醬菜中分別分離獲得了乳酸菌和霉菌。在本研究中還注意到，能夠分離獲得乳酸菌的醬菜中沒有分離到霉菌，而分離到霉菌的醬菜中，則沒能分離到乳酸菌。本研究從醬菜中分離得到的3 株乳酸菌對醬菜中分離的一株青霉屬菌株具有良好的抑菌效果。經16S rDNA序列分析，3 株具有抑制青霉菌的菌株分別為彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌和植物乳桿菌，說明了在醬菜中存在著乳酸菌的自然生長，而且還具有一定的多樣性。繼續(xù)檢測3 株乳酸菌對其他幾種從醬菜中分離的污染霉菌的作用，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對醬菜中分離的這些霉菌都具有較好的抑菌效果，這也一定程度上說明了能分離乳酸菌的醬菜中分離不到霉菌的原因，而且3 株乳酸菌對產毒霉菌中的黃曲霉及赭曲霉也表現(xiàn)出了明顯的抑菌作用。對乳酸菌抑菌活性有效成分的分析顯示，抑菌活性成分對熱穩(wěn)定，對pH值變化敏感，對蛋白酶的處理也表現(xiàn)不同的敏感性，推測抑菌作用有效成分可能為小肽類和/或有機酸。由此可知，3 株乳酸菌在醬菜防霉變中可以起到良好的廣譜抑菌作用，這對醬菜貯存具有重要意義。當前食品加工正向著低鹽、低防腐劑甚至無防腐劑方向發(fā)展，乳酸菌不僅可以抑菌，而且可以提高風味和加強腸道微生態(tài)平衡，本實驗篩選的抑制霉菌的乳酸菌既具有醬菜防腐方面的利用價值，同時可降低鹽和防腐劑的用量，為進一步研究開發(fā)生物防腐提供了有價值的菌種資源。

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Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria Inhibiting Penicillium and Analysis of Their Antimicrobial Components

LI Yuan, WEI Xinyuan*, WANG Jing, DING Wu, ZHENG Fangyuan, HU Xianmiao, KOU Liping*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective: The aim of this study was to isolate and identify lactic acid bacteria able to inhibit Penicillium from various pickles. The antibacterial activity was determined against the dominant molds in pickles and toxin-producing fungi and the active compounds produced by the obtained isolates against Penicillium were analyzed. The molecular biological identification of strains was performed by molecular biological methods. Methods: By the double-layer plate method, lactic acid bacteria with antimicrobial activity against Penicillium were screened from the pickles. The inhibitory effects of lactic acid bacteria against fungi from the pickles and mycotoxin-producing fungi preserved in our lab were determined, and the active substances from lactic acid bacteria were analyzed by protease digestion, pH adjustment and heating. These lactic acid bacteria were then identified via 16S rDNA sequence analysis after PCR amplification. Results: Three strains were screened from 14 dominant lactic acid bacterial strains isolated from the pickles for high inhibitory activity against fungi isolated from the pickles and 2 toxigenic fungi. Treatment with different proteases and pH adjustment had different effects on the antibacterial activity of the concentrated culture supernatant of lactic acid bacteria, while three heat treatments did not affect the inhibitory efficiency. Three lactic acid bacteria were identified as L. curvatus, L. sakei and L. plantarum, respectively. Conclusion: Lactic acid bacteria screened from pickles have high inhibitory activity on Penicillium and some toxigenic fungi, suggesting that the strains can be used as biological preservative to extend the shelf life of pickles, and its antibacterial ingredients may be small peptides and/or organic acids.

pickles; lactic acid bacteria; fungi; antimicrobial component; antibacterial activity

Q935

A

1002-6630（2015）21-0150-06

10.7506/spkx1002-6630-201521029

2014-11-13

西北農林科技大學基本科研業(yè)務費專項資金項目（QN2011138）

李院（1990—），女，碩士研究生，研究方向為乳酸菌抑菌。E-mail：liyuan814515@163.com

*通信作者：魏新元（1971—），男，副教授，博士，研究方向為食品高新技術。E-mail：wheixinyuan@126.com

寇莉萍（1972—），女，副教授，博士，研究方向為果蔬加工。E-mail：kouliping8@hotmail.com