重組枯草芽孢桿菌分泌表達腺苷酸脫氨酶

郭自濤，張 梁，李由然，李 贏，顧正華，丁重陽，石貴陽

（糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

重組枯草芽孢桿菌分泌表達腺苷酸脫氨酶

郭自濤，張 梁*，李由然，李 贏，顧正華，丁重陽，石貴陽

（糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

目的：利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建腺苷酸脫氨酶高效表達的重組菌株。方法：以前期構(gòu)建的產(chǎn)腺苷酸脫氨酶重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中來源于鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）目的基因為模板，設(shè)計特異性引物擴增腺苷酸脫氨酶基因，亞克隆至游離型表達載體pHY-WZX，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600。結(jié)果：成功篩選獲得了一株產(chǎn)腺苷酸脫氨酶重組枯草芽孢桿菌WB600/pHY-AMPD，進一步在搖瓶中探究了發(fā)酵培養(yǎng)基成分對重組酶發(fā)酵的影響。獲得了較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl20.5 g/L、檸檬酸三鈉1 g/L、NaH2PO410 g/L、K2HPO410 g/L、(NH4)2SO45 g/L，37 ℃、200 r/min發(fā)酵60 h搖瓶發(fā)酵液酶活力可達到（2 230±50） U/mL。結(jié)論：本研究實現(xiàn)了鼠灰鏈霉菌來源的腺苷酸脫氨酶基因在枯草芽孢桿菌中表達。

腺苷酸脫氨酶；鼠灰鏈霉菌；枯草芽孢桿菌；重組表達

腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，AMPD，EC 3.4.5.6）廣泛存在于各種生物體內(nèi)，包括微生物、動物以及人體內(nèi)，它在真核生物能量代謝中起著非常重要的作用[1]。腺苷酸脫氨酶是一種氨基水解酶，在嘌呤代謝循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用。在一定反應(yīng)條件下，它能催化腺苷酸脫去氨基產(chǎn)生肌苷酸（inosinic acid，IMP）和NH3[2]，IMP是一種在核糖核酸（RNA）中發(fā)現(xiàn)的核苷酸，可用作食品調(diào)味劑和藥品。其二鈉鹽與谷氨酸鈉（味精）混合使用，呈味作用比單用味精高數(shù)倍，有“強力味精”之稱；在醫(yī)藥方面，適用于各種原因引起的白細胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外尚可治療中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。

伴隨著食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的不斷發(fā)展，人類對腺苷酸脫氨酶需求量不斷增大。早期主要應(yīng)用哺乳動物細胞進行生產(chǎn)腺苷酸脫氨酶，不僅生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，而且效率低，產(chǎn)量不高，不能滿足需求。目前，工業(yè)生產(chǎn)腺苷酸脫氨酶通常使用微生物進行固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵，所使用的微生物多數(shù)為經(jīng)過篩選得到的可產(chǎn)生腺苷酸脫氨酶的野生菌株，如蜂蜜曲霉[3]、米曲霉[4-5]、酵母[6]等，但是酶活性普遍較低。例如，普為民等[7]從青霉和曲霉中篩選到一株產(chǎn)AMPD的蜂蜜曲霉，通過紫外誘變處理和優(yōu)化后，該菌所產(chǎn)的脫氨酶活性達到1 300 U/mL。梅光明等[8]從自然發(fā)酵乳中篩選出AMPD活性最高的菌株進行初步鑒定，結(jié)果為毛霉菌屬，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后，酶活力達到472.3 U/mL。王普行等[9]從曲霉菌中篩選到一株產(chǎn)AMPD較高的菌株，對其發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件進行研究后，該菌株酶活力為600 U/mL。同時，在生產(chǎn)過程中存在諸多問題，如固態(tài)發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)混入酶液，造成酶的提取純化工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本增加；液態(tài)發(fā)酵時酶活力提高困難和發(fā)酵穩(wěn)定性問題等。目前，國內(nèi)外使用基因重組技術(shù)構(gòu)建重組菌株進行生產(chǎn)方面的研究較少，公開的報道主要由日本天野酶株式會社[10]和江南大學(xué)發(fā)布的專利[11-13]。利用基因重組技術(shù)，尋找合適的微生物來源的AMPD基因以及合適的表達體系，從而獲得AMPD高效表達，具有十分重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB600/ pHY-WZX，產(chǎn)腺苷酸脫氨酶重組大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pET28α-AMPD，腺苷酸脫氨酶基因來源于鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）（菌種保藏號：MCCC 1A01641），為江南大學(xué)國家工程實驗室構(gòu)建和保藏。

質(zhì)粒：pHY-WZX，為江南大學(xué)國家工程實驗室構(gòu)建和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、四環(huán)素0.03 g/L，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糊精10 g/L、棉籽粉40 g/L、NaH2PO410 g/L、K2HPO410 g/L、檸檬酸三鈉2 g/L、(NH4)2SO45 g/L、CaCl20.5 g/L、四環(huán)素0.03 g/L，蒸餾水1 L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 加拿大Fermentas公司；酵母膏、胰蛋白胨、腺苷酸（5’-AMP） 美國Sigma公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒 北京博大泰克生物技術(shù)公司；Ex Taq DNA聚合酶 日本TaKaRa公司；四環(huán)素、溶菌酶與RNase 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 AMPD基因的克隆

以美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）報道的鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus）AMPD基因為模板，設(shè)計聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：前端序列EcoRI：5’-TTAGAATTCGCGCCGCCGCCCCGGC AGGC-3’，末端序列KpnI：5’-TTAGGTACCTCACCCCC GGGCGTGCGCCC-3’（下劃線為EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點）。

以已構(gòu)建好的E. coli BL21（DE3）/pET28-AMPD的染色體為模板，以SE up EcoRⅠ，SE up KpnⅠ為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：模板4 μL，2×GC buffer 50 μL，上下游引物各2 μL，Ex Taq 1 μL，dNTPmix 10 μL，滅菌的ddh2O 31 μL。PCR擴增條件為：96 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分析。PCR產(chǎn)物通過純化試劑盒純化后用于表達質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.3 枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)制備

參照方煒[14]方法制備。

1.4 重組枯草芽孢桿菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將經(jīng)過EcoRⅠ-KpnⅠ線性化的載體pHY-WZX與經(jīng)EcoRⅠ-KpnⅠ消化的PCR基因片段用純化試劑盒純化后，按照質(zhì)量比1∶10的比例加入10 μL體系，于16 ℃培養(yǎng)箱連接過夜。向剛準備好的枯草芽孢桿菌wB600感受態(tài)中加入適量的質(zhì)粒，輕輕混勻于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2.5 h。以5 000 r/min離心3 min收集菌體，棄部分上清后留100 μL重懸菌體，涂布含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基平板，37 ℃過夜培養(yǎng)10 h。挑取轉(zhuǎn)化子用SE up EcoRⅠ/SE down KpnⅠ為引物進行菌落PCR，挑取菌落PCR正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ-KpnⅠ酶切驗證目的基因的大小。

1.5 AMPD酶活力測定[15-16]

準確稱取13.9 mg腺苷酸溶于1 mL 0.08 mol/L的NaHCO3溶液中作為原始底物，然后用399 mL的0.1 mol/L琥珀酸-NaOH緩沖液（pH 5.9）將其稀釋400 倍，最終得到終濃度為0.1×10－3mol/L的反應(yīng)底物。移取3 mL反應(yīng)底物在35 ℃保溫5 min，加入預(yù)稀釋的AMP脫氨酶酶液0.1 mL，立刻計時反應(yīng)15 min，15 min后加入3 mL 10 g/100 mL的過氯酸溶液終止反應(yīng)。

對照組實驗方法同上，反應(yīng)底物保溫后用冰水預(yù)冷，加過氯酸溶液后再加酶液。反應(yīng)結(jié)束后，在265 nm波長處，用光程10 mm的石英比色皿，以水為參比測量吸光度。

酶活力單位定義：在上述條件下每分鐘吸光度改變0.001，定義為一個酶活力單位。計算公式為：

式中：ΔA265nm為反應(yīng)液與對照吸光度的差值；K為粗酶液的稀釋倍數(shù)；t為酶反應(yīng)時間/min。

1.6 重組菌生長曲線的測定

從平板上挑取重組枯草芽孢桿菌單菌落接種于裝有50 mL的含有四環(huán)素終質(zhì)量濃度30 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。之后，以10%的接種量接種于若干裝有50 mL的含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測OD600nm值。以時間為橫坐標，OD600nm為縱坐標作圖。

1.7 重組蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

將篩選得到的陽性枯草芽孢桿菌重組子WB600/pHYAMPD以及枯草芽孢桿菌WB600/pHY-WZX接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，然后取發(fā)酵上清進行SDS-PAGE分析。

1.8 重組枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵研究[17-20]

1.8.1 考察不同碳源對重組菌發(fā)酵的影響

分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘油、麥芽糊精各10 g/L為碳源對重組菌進行搖瓶發(fā)酵。

1.8.2 考察不同氮源對重組菌發(fā)酵的影響

確定碳源后，分別以40 g/L的魚粉蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏、硫酸銨、魚粉蛋白胨+酵母膏（質(zhì)量比1∶1）復(fù)合氮源替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中棉籽粉為氮源進行搖瓶發(fā)酵。

1.8.3 考察不同金屬離子對重組菌發(fā)酵的影響

在確定碳源和氮源的基礎(chǔ)上，分別向培養(yǎng)基中添加0.5 g/L的CaCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MgSO4·7H2O、MnSO4、CuSO4，以不添加任何其他金屬離子的培養(yǎng)基為空白對照進行搖瓶發(fā)酵。

1.8.4 考察不同質(zhì)量濃度檸檬酸鹽對重組菌發(fā)酵的影響

分別向培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的檸檬酸三鈉，以不加檸檬酸三鈉的培養(yǎng)基為空白對照進行搖瓶發(fā)酵實驗。

1.8.5 正交試驗優(yōu)化[21-23]

通過以上4 種培養(yǎng)基成分的探究，為了選擇出一個最佳的培養(yǎng)基組合，進行了四因素三水平的正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)AMPD重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建與表達

2.1.1 AMPD基因的克隆與分析

擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示，在1 100～1 700 bp中間部分有單一的擴增片段，與目的基因片段大?。? 476 bp）基本一致。

的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR product of the AMPD gene圖1 AMPD 基因

2.1.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

挑取陽性克隆菌的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ-KpnⅠ酶切驗證，如圖2所示，pHY-WZX質(zhì)粒大小為6 702 bp，目的基因片段為1 476 bp，結(jié)果表明目的片段已經(jīng)成功插入到pHY-WZX質(zhì)粒中。

Ⅰ酶切驗證結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme digestion of the recombinant vector pHY-AMPD by EcoRI-KpnI圖2 pHY-AMPD用EcoRⅠ-Kpn

2.1.3 重組枯草芽孢桿菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

圖 3Bacillus subtilis /pHY-AMPD的SDS-PAGE蛋白電泳分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of pHY-AMPD Bacillus subtilis

如圖3所示，轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵上清液在60 kD出現(xiàn)一條明顯的條帶，而對照菌株（Bacillus subtilis WB600/pHY）在該處沒有條帶。該條帶的分子質(zhì)量與日本專利文獻[7]報道中的大小相吻合，說明目的基因已經(jīng)得到了表達。

2.1.4 重組菌生長曲線

圖4 重組枯草芽孢桿菌WB600/pHY-AMPD生長曲線Fig.4 The gorwth curve of recombinant Bacillus subtilis WB600/pHY-AMPD

如圖4所示，0～2 h為適應(yīng)期，2～12 h為對數(shù)生長期，12～17 h為穩(wěn)定期，17～24 h菌體逐漸衰亡。

2.2 重組菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

圖5 不同碳源對菌體生長和酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

由圖5可知，各種碳源對重組菌的酶活力影響較大。其中以葡萄糖為碳源時，目標菌的酶活力水平最高，超過了1 500 U/mL。而以麥芽糊精為碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基酶活力為1 240 U/mL。說明在所有碳源中，葡萄糖是最有利于目標菌的產(chǎn)酶。同時，葡萄糖與蔗糖對細胞的生長均有明顯的促進作用，但蔗糖對目標菌的產(chǎn)酶相對較低。因此，培養(yǎng)基的碳源選擇葡萄糖。

2.2.2 培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

圖6 不同氮源對菌體生長和酶活力的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

如圖6所示，無機氮源產(chǎn)酶能力較低且菌體生長相對較差；有機氮源更有利于促進產(chǎn)酶和菌體的生長。在有機氮源中，酵母膏相對來說能夠更好地促進該重組菌的生長和產(chǎn)酶。因此，選取酵母膏作為氮源。

2.2.3 培養(yǎng)基金屬離子的優(yōu)化

圖7 不同金屬離子對菌體生長和酶活力的影響Fig.7 Effect of different metal ions on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

如圖7所示，在0.5 g/L的質(zhì)量濃度下，Ca2+對細胞生長及產(chǎn)酶有較大的促進作用，而其他的金屬離子則沒有表現(xiàn)出對目標菌的生長及產(chǎn)酶很好的促進作用，甚至出現(xiàn)了一定程度的抑制作用。而當(dāng)培養(yǎng)基中加入Cu2+時，盡管OD600nm值很高，但是酶活水平卻很低，而酶活水平又與細胞量成正相關(guān)。因此，可能的原因是：Cu2+抑制了酶與底物的反應(yīng)，或者Cu2+抑制了細胞的產(chǎn)酶過程。

2.2.4 檸檬酸鹽質(zhì)量濃度的優(yōu)化

圖8 不同質(zhì)量濃度檸檬酸鹽對菌體生長和酶活力的影響Fig.8 Effect of citrate concentration on the growth and AMP deaminase activity of recombinant strain

由圖8可知，在實驗選定的檸檬酸鹽質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白對照組相比，細胞的生長量及酶的產(chǎn)量均有一定程度的提高，此結(jié)果說明，檸檬酸對目標菌的生長及產(chǎn)酶是有促進作用的。當(dāng)檸檬酸鹽質(zhì)量濃度為2 g/L時產(chǎn)酶活力最高，比不添加檸檬酸鹽時酶活力提高了78.8%。

2.2.5 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基配方

由表1可知，最優(yōu)的培養(yǎng)基組合方案為：葡萄糖10 g/L、酵母膏30 g/L、CaCl20.5 g/L、檸檬酸三鈉1.0 g/L。在該培養(yǎng)基組合下，酶活力最高可達2 100 U/mL，相對于初始發(fā)酵培養(yǎng)基的酶活力（1 240 U/mL），提高了近70%。

根據(jù)正交試驗得出的最優(yōu)培養(yǎng)基組合，進行對試驗結(jié)果的驗證實驗，以驗證該最優(yōu)培養(yǎng)基是否能使目標菌達到菌體生長量及酶活力水平都有較大地提高。該驗證實驗中，最高酶活力在2 230 U/mL，最高OD600nm值可達到8.0，說明正交試驗得到的結(jié)論是有效的。

表1 培養(yǎng)基配方的正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimizing medium components

3 討 論

本實驗通過基因重組技術(shù)，成功地將來源于鼠灰鏈霉菌的目的基因通過克隆構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌進行表達；利用單因素和正交試驗對重組枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了研究，確定了較優(yōu)培養(yǎng)基組成，最高酶活力可達（2 230±50） U/mL，約為原始菌株鼠灰鏈霉菌AMPD表達水平的3.7 倍（原始菌株酶活力約為600 U/mL）。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建重組菌生產(chǎn)的酶的活性明顯優(yōu)于野生菌株，更能夠滿足AMPD未來在行業(yè)內(nèi)的需求。

本實驗實現(xiàn)了鼠灰鏈霉菌來源的AMPD在枯草芽孢桿菌中的表達，該研究對國內(nèi)通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)AMPD具有一定的指導(dǎo)意義，但是距離工業(yè)化應(yīng)用的要求還有一定的差距。后續(xù)工作將著重于生產(chǎn)放大工藝的研究，以期通過研究提高酶活水平，為AMPD的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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Expression of Adenosine Deaminase in Recombinant Bacillus subtilis

GUO Zitao, ZHANG Liang*, LI Youran, LI Ying, GU Zhenghua, DING Zhongyang, SHI Guiyang
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, College of Biological Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective: To construct a recombinant strain to express adenosine deaminase (AMPD) efficiently. Methods: The AMPD gene from Streptomyces murinus was expressed in E. coli DE3/pET28α-AMPD. Specific primers were designed to amplify the AMPD gene. The PCR product was cloned into the plasmid pHY-WZX, and the recombinant plasmid was transformed into Bacillus subtilis WB600. Results: The recombinant Bacillus subtilis WB600/pHY-AMPD was successfully constructed to express AMPD. Furthermore, the fermentation medium was optimized to contain 10 g/L glucose, 30 g/L yeast extract, 0.5 g/L CaCl2, 1 g/L sodium citrate, 10 g/L NaH2PO4, 10 g/L K2HPO4, and 0.5 g/L (NH4)2SO4. The enzyme activity reached (2 230 ± 50) U/mL after shake flask cultivation at 37 ℃ for 60 h with a shaking speed of 200 r/min. Conclusion: The AMPD gene from Streptomyces murinus has been successfully expressed in Bacillus subtilis.

adenosine deaminase; Streptomyces murinus; Bacillus subtilis; recombinant expression

Q815

A

1002-6630（2015）21-0135-05

10.7506/spkx1002-6630-201521026

2014-11-26

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100905）；教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目（NCET-11-0665）；

江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-ZZA-201201）

郭自濤（1987—），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵過程工程。E-mail：hnpygzt@163.com

*通信作者：張梁（1978—），男，教授，博士，研究方向為酶工程與技術(shù)和農(nóng)業(yè)益生菌。E-mail：zhangl@jiangnan.edu.cn