酒精發(fā)酵過程中電導率變化趨勢解析

李沖偉，宋福強，宋 永，沈志偉

（1. 黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；

2. 黑龍江大學 教育部農業(yè)微生物技術工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

酒精發(fā)酵過程中電導率變化趨勢解析

李沖偉1,2，宋福強2,*，宋 永1,2，沈志偉1

（1. 黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；

2. 黑龍江大學 教育部農業(yè)微生物技術工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

基于本實驗室前期發(fā)現(xiàn)電導率在酒精發(fā)酵過程中存在著先降低后升高的變化趨勢，采用等離子體發(fā)射光譜法等物理化學方法，研究了4 種主要陽離子質量濃度、還原糖質量濃度、乙醇體積分數(shù)、酵母細胞濃度、ph值對酒精發(fā)酵過程中電導率變化規(guī)律的影響。結果表明：4 種主要離子質量濃度、還原糖質量濃度、乙醇體積分數(shù)、酵母細胞濃度和ph值均能影響電導率的變化，其中起決定性作用的是乙醇體積分數(shù)；電導率下降的主要原因是發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)在持續(xù)增加；當乙醇體積分數(shù)不再增加時，電導率受到氫離子質量濃度的影響轉為上升趨勢。由此驗證，發(fā)酵液中電導率的變化直接受乙醇體積分數(shù)變化的影響。

酒精發(fā)酵；電導率；乙醇體積分數(shù)；還原糖質量濃度

酒精生產中最重要的一步是糖化發(fā)酵環(huán)節(jié)，直接影響到產品的質量和企業(yè)的經濟效益。然而發(fā)酵過程何時結束，何時將發(fā)酵液送至蒸餾車間。一直以來，人們都是采用從發(fā)酵罐取樣，在實驗室進行指標檢驗。這種離線檢測，不僅錯過了最恰當?shù)呐欧艜r間，延長了生產周期，同時每4 h測定1 次乙醇含量和還原糖的工作，增加了人力、物力和財力的消耗[1]。從20世紀80年代開始，國內外專家就致力于研究發(fā)酵過程動態(tài)和終點的在線監(jiān)測問題。例如，Spinnler等[2]基于ph值研究了酵母細胞活力的自動檢測技術，但效果并不明顯。馮金垣等[3]采用獨特設計的液芯光波導濃度傳感器用于在線測量乙醇濃度，但此儀器設備結構較復雜，且測量精度受電源和電路的干擾較大。楊海麟等[4]利用超聲波檢測原理，設計了用于乙醇含量在線監(jiān)測的超聲波傳感器，然而該傳感器受發(fā)酵液溫度和雜質含量的影響較大。竇少華等[5]通過實驗建立了啤酒發(fā)酵過程中電導率與幾個重要發(fā)酵參數(shù)的數(shù)學模型，以期找到一種快速檢測方法代替離線檢測。朱艷英等[6]利用傳感器測定乙醇含量和糖度的輸出信號，通過模式轉換從而實現(xiàn)糖度和乙醇含量的在線測量。王豪等[7]利用傅里葉變換近紅外光譜法測定葡萄酒中的乙醇含量，期望找到一種在線測定乙醇含量的方法，該設備結構復雜且價格昂貴。王建林等[8]利用金屬氧化物半導體材料為氣敏元件，在發(fā)酵液中插入膜透取樣器進行乙醇蒸汽的采集和檢測，該儀器設備結構復雜，且誤差較大。目前，僅奧地利安東帕公司的在線監(jiān)測系統(tǒng)在啤酒發(fā)酵過程中有應用，但還沒有應用到酒精發(fā)酵過程的檢測，且設備價格較高。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在酒精發(fā)酵周期內，發(fā)酵液的電導率曲線呈現(xiàn)先下降后上升的變化規(guī)律[9]，在電導率達到最低點的時刻，發(fā)酵液的乙醇體積分數(shù)和還原糖質量濃度，基本達到發(fā)酵終點的指標要求，即電導率的最低點接近發(fā)酵終點。本實驗旨在研究酒精發(fā)酵過程中電導率變化的機理和影響因素，期望通過改善影響因素、構建電導率和乙醇體積分數(shù)之間更加合理的數(shù)學模型，為酒精發(fā)酵過程的在線監(jiān)測尋找一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

酒精酵母：安琪釀酒高活性干酵母 江蘇銳陽生物科技有限公司。

玉米粉 市售，玉米碴粉碎后過40 目篩，含水量16.84%。

α-淀粉酶（酶活力3 700 U/g）、糖化酶（酶活力100 000 U/g） 南京林諾工貿有限公司；NaCl 天津科密歐化學試劑有限公司；丙酮 天津博迪化工股份有限公司；葡萄糖、CaCl2、(Nh4)2SO4、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

Optima 7000DV等離子體發(fā)射光譜儀 美國鉑金埃爾默有限責任公司；BX53奧林巴斯生物顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Fw 100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；Jy92-IIDN超聲破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；EC-214電導率儀 北京哈納科儀科技有限公司；3 L不銹鋼發(fā)酵罐 瑞士比歐生物工程公司（上海）；PhS-3C酸度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒精發(fā)酵生產工藝

配料：取適量玉米粉，料液比為1∶3.5（m/V）。

液化：淀粉酶用量為56 U/g，CaCl2添加量為3.0 g/L，60 ℃條件下持續(xù)液化30 min，100 ℃條件下持續(xù)液化90 min，ph 6.0。

糖化：糖化酶用量為334 U/g， 60 ℃條件下糖化時間0.5 h，ph 4.0。

發(fā)酵：酵母接種量為3%，(Nh4)2SO4用量為1 g/L，發(fā)酵時間90 h，0～12 h發(fā)酵溫度為30～32 ℃，12～72 h發(fā)酵溫度為32～34 ℃，72～90 h發(fā)酵溫度為30～32 ℃，采用3 L不銹鋼發(fā)酵罐發(fā)酵，每次取樣前攪拌。

1.3.2 酒精發(fā)酵過程中電導率與還原糖質量濃度和乙醇體積分數(shù)的測定

從制備好的糖化醪接種酵母開始，每4 h測量發(fā)酵液的電導率、還原糖質量濃度和乙醇體積分數(shù)，并繪制發(fā)酵過程中3 個參數(shù)隨時間變化的關系曲線。

還原糖質量濃度的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[10]；電導率的測定采用在線測量，每次測量前攪拌發(fā)酵液；乙醇體積分數(shù)測定采用蒸餾法[11]。

1.3.3 酒精發(fā)酵過程中相關因素對電導率的影響

1.3.3.1 幾種主要離子質量濃度對電導率的影響

考慮到電導率的下降可能與發(fā)酵液中離子質量濃度的變化有關，測定了酒精發(fā)酵前期（12、24、36、48 h）發(fā)酵液中K+、Na+、Ca2+、Mg2+4 種主要陽離子的質量濃度。4 種陽離子質量濃度的測定采用等離子體發(fā)射光譜法，等離子氣體流量15 L/min，輔助氣體流量0.2 L/min，霧化器氣體流量0.8 L/min，射頻功率1 300 w，蠕動泵流量1.5 mL/min[12]。

1.3.3.2 ph值對電導率的影響

從發(fā)酵0 h開始，每4 h測量發(fā)酵液的電導率和ph值，觀察兩者的變化關系。同時，為了考察h+質量濃度對電導率的影響，利用不同ph值的鹽酸溶液模擬酒精發(fā)酵過程中不同階段的ph值，考察不同ph值對電導率的影響。ph值利用酸度計進行測定。

1.3.3.3 還原糖質量濃度對電導率的影響

在具有電導的溶液中分別加入不同質量的葡萄糖，模擬酒精發(fā)酵過程不同階段還原糖質量濃度，研究酒精發(fā)酵過程中還原糖質量濃度對電導率的影響。由于葡萄糖是非電解質，本身并沒有導電性，以質量濃度0.1 g/L NaCl溶液（電導率為2.45 mS/cm）替代發(fā)酵液的導電性能。取NaCl溶液，分別添加葡萄糖，制成還原糖終質量濃度為10、8、6、4、2 g/L的溶液，25 ℃條件下測定5 種不同溶液的電導率。

1.3.3.4 乙醇體積分數(shù)對電導率的影響

在具有電導的溶液中分別加入不同體積的乙醇，模擬酒精發(fā)酵過程不同階段的乙醇體積分數(shù)，研究乙醇體積分數(shù)對電導率的影響。由于酒精是非電解質，本身并沒有導電性，同樣以質量濃度0.1 g/L NaCl溶液替代發(fā)酵液的導電性能。取質量濃度0.1 g/L的NaCl溶液，分別添加一定比例的無水酒精，制成乙醇體積分數(shù)為1%、3%、5%、7%、9%、11%的溶液，25 ℃條件下測定6 種溶液的電導率。

1.3.3.5 酵母細胞濃度對電導率的影響

為了考察酒精發(fā)酵過程中酵母細胞濃度對電導率的影響，取對數(shù)生長期的釀酒酵母（8.2×106CFU/mL），用無菌生理鹽水溶液分別稀釋0、2、4、6、8 倍，然后測定5 種稀釋液中細胞的OD600nm值和電導率，OD600nm值測定采用濁度法[13]。

1.3.4 麥角甾醇含量和丙二醛濃度的測定

麥角甾醇是真菌細胞膜結構的重要組成成分，具有調節(jié)真菌細胞膜流動性的功能，在細胞膜結構的完整性、細胞活力以及物質運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔?。一旦麥角甾醇缺乏，必將引起真菌細胞膜功能異常，甚至發(fā)生細胞破裂。脂質過氧化反應也是機體內重要的反應過程，一旦機體內活性氧平衡被打破，就會發(fā)生脂質過氧化反應，形成脂質過氧化產物，如丙二醛（malondialcehyde，MDA）等，使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，最終導致細胞結構和功能的改變。本實驗選取了56、58、60、62、64 h作為實驗時間點，測定了發(fā)酵液酵母細胞內麥角甾醇含量[14]和MDA濃度[15]，并利用顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化。

1.3.5 細胞死亡數(shù)量對發(fā)酵液電導率的影響

為了測定細胞死亡數(shù)量對發(fā)酵液電導率的影響，采用TCA方法對酵母細胞溶液進行破碎，并測定破碎液的電導率，同時以不破碎的細胞溶液作對照，比較兩種細胞溶液的電導率。TCA方法如下：取50 mL細胞懸液，加入5.56 mL 100%丙酮，冰浴30 min[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS 11.5進行統(tǒng)計分析，差異顯著性分析采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中電導率與還原糖質量濃度和乙醇體積分數(shù)的變化曲線

圖1 發(fā)酵過程中電導率與乙醇體積分數(shù)和還原糖質量濃度的變化關系Fig.1 Change in electrical conductivity as a function of alcohol and reducing sugar concentration during fermentation process

由圖1可知，隨著發(fā)酵過程的進行，乙醇體積分數(shù)逐漸上升，還原糖質量濃度逐漸下降，電導率首先呈現(xiàn)下降趨勢，在發(fā)酵60 h附近，電導率停止下降趨勢轉為反彈上升。在電導率的最低點，乙醇體積分數(shù)上升到11.5%，還原糖質量濃度下降到1.433 mg/mL。

2.2 酒精發(fā)酵前期電導率下降原因分析

2.2.1 發(fā)酵液中K+、Na+、Ca2+、Mg2+質量濃度對電導率的影響

在液體中常以電導率來衡量溶液的導電性能。溶液中陽離子質量濃度越高，導電性能越強，則電導率越大[17]。由表1可知，在12～60 h，發(fā)酵液中電導率逐漸下降，而幾種主要陽離子質量濃度是逐漸上升的，發(fā)酵60 h和12 h相比較，K+質量濃度上升65.19%，Na+質量濃度上升62.72%，Ca2+質量濃度上升331.3%，Mg2+質量濃度上升107.78%，由此說明，電導率的變化不是這幾種陽離子質量濃度變化所引起的；在60～62 h，發(fā)酵液中電導率是上升的，而這時溶液中幾種陽離子質量濃度也是上升的，K+質量濃度上升7.05%，Na+質量濃度上升19.27%，Ca2+質量濃度上升20.87%，Mg2+質量濃度上升12.70%。由此又說明，電導率的變化可能與這幾種陽離子質量濃度的變化有關。

表1 不同時間發(fā)酵液中4 種陽離子質量濃度Table 1 Concentrations of four ions in fermented liquid at different fermentation times mg/L

2.2.2 ph值對電導率的影響

酒精發(fā)酵過程是溶液中的葡萄糖逐漸被利用分解，產生乙醇和其他酸性物質，導致h+質量濃度增加[18]。每4 h測量發(fā)酵液的電導率和ph值，得到ph值與電導率隨時間的變化曲線，結果見圖2。從0～60 h，酒精發(fā)酵過程中，電導率和ph值均呈下降趨勢，電導率從5.11 mS/cm下降到3.42 mS/cm，下降1.69 mS/cm（33.07%）。ph值從3.61下降到1.24，下降2.37（65.65%）。經過60 h（電導率拐點）后，在60～64 h期間，h+質量濃度持續(xù)增加，ph值仍呈下降趨勢，ph值下降10.22%，電導率停止下降轉呈上升趨勢，上升5.08%。在64～68 h期間，ph值減緩下降趨勢，4 h內下降0.81%，電導率同時也減緩上升趨勢，上升1.39%。由此說明，電導率下降速率受ph值下降速率的影響較大，這兩者之間應該存在著一定的線性關系。由圖3可知，ph值從4.48下降至1.84，電導率是從5.43 mS/cm逐漸上升到8.26 mS/cm，而實際發(fā)酵過程中，隨著ph值下降，發(fā)酵液的電導率也是逐漸下降的，由此可知，ph值的降低會導致溶液電導率的上升，圖2中60～68 h期間電導率的上升應該就是ph值下降引起的，68 h之后兩者均基本不變，綜上分析，ph值不是影響電導率下降的主要因素。

圖2 發(fā)酵過程中pH值與電導率變化關系Fig.2 Changes in pH and electrical conductivity during fermentation process

圖3 不同pH值對電導率的影響Fig.3 Relationship between electrical conductivity and pH

2.2.3 還原糖質量濃度對電導率的影響

圖4 不同還原糖質量濃度對電導率的影響Fig.4 Relationship between electrical conductivity and reducing sugar concentration

由圖4可知，隨著還原糖質量濃度從10 g/L降到2 g/L，電導率從1.96 mS/cm上升到2.35 mS/cm，說明還原糖質量濃度的降低會導致溶液電導率的上升（這可能與葡萄糖屬于非電解質有關）[19]，而實際發(fā)酵過程中，隨著還原糖質量濃度的降低，電導率是下降的。由此可知，還原糖質量濃度不是導致電導率下降的主要因素。

2.2.4 酵母細胞濃度對電導率的影響

圖5 不同酵母細胞濃度對電導率的影響Fig.5 Relationship between electrical conductivity and cell concentration

由圖5可知，隨著酵母細胞濃度（OD600nm值）的增加，電導率從0.06 mS/cm上升到0.36 mS/cm，上升0.30 mS/cm；隨著酒精發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵液的酵母細胞濃度逐漸增加，發(fā)酵液的電導率呈上升趨勢，而實際酒精發(fā)酵過程0～60 h期間電導率是下降的。由此可知，酵母細胞濃度也不是導致電導率下降的主要因素，這與Meng等[20]的結論一致。

2.2.5 乙醇體積分數(shù)對電導率的影響

圖6 不同乙醇體積分數(shù)對電導率的影響Fig.6 Relationship between electrical conductivity and alcohol concentration

由圖6可知，隨著乙醇體積分數(shù)從1%增加到11%，電導率從2.45 mS/cm下降到1.34 mS/cm，下降1.11 mS/cm（45.3%），下降變化趨勢比較明顯，這與酒精發(fā)酵過程中電導率的下降趨勢是基本一致的。酒精溶液屬于非電解質[21]，隨著溶液中乙醇體積分數(shù)的增加，溶液的導電性能越差，這也正好解釋了酒精發(fā)酵過程中隨著乙醇的生成，電導率逐漸降低的原因。

2.3 酒精發(fā)酵后期電導率止降回升的原因分析

2.3.1 電導率拐點前后酵母細胞的形態(tài)變化

為了探究電導率拐點（發(fā)酵60 h）附近細胞形態(tài)變化對電導率的影響，本實驗觀察了電導率拐點前后細胞形態(tài)的變化。由圖7可知，發(fā)酵56～68 h期間，細胞形態(tài)從外觀上并沒有出現(xiàn)明顯的變化，酵母細胞的死亡率呈線性變化，從16.78%有規(guī)律地增加到36.96%（透明的酵母細胞為活細胞，染色的酵母細胞為死細胞）。

圖7 不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中的酵母細胞形態(tài)Fig.7 Cell morphology at during fermentation times

2.3.2 電導率拐點前后酵母細胞中麥角甾醇含量和MDA濃度的變化

圖8 不同發(fā)酵時間酵母細胞中麥角甾醇含量（a）和MDA濃度（b）Fig.8 Ergosterol content (a) and MDA content (b) in yeast cells at different fermentation times

由圖8a可知，發(fā)酵液酵母細胞中麥角甾醇含量從0.044 6 mg/g降到0.012 4 mg/g，下降了72.2%，并且呈線性下降趨勢（R2＝0.996 8），說明細胞膜完整性和通透性的改變是一個緩慢的線性變化過程[22]。通過測定56～64 h發(fā)酵液酵母細胞中MDA濃度的變化，可以反映出細胞脂質過氧化反應的程度，即細胞膜通透性能的大小。由圖8b可以看出，從56～64 h酵母細胞中MDA濃度從0.026 μmol/L上升到0.119 μmol/L，上升了357.7%，并且呈線性上升趨勢（R2＝0.951 6），說明細胞過氧化反應的發(fā)生是循序漸進地進行。

3 結 論

本實驗通過研究酒精發(fā)酵過程中陽離子質量濃度、還原糖質量濃度、ph值、乙醇體積分數(shù)和酵母細胞濃度等宏觀變量對電導率變化的影響，得到了如下結論：通過單因素試驗證明，乙醇體積分數(shù)是電導率變化的決定性因素。隨著乙醇體積分數(shù)的增加，溶液的電導率下降，這與酒精發(fā)酵過程中乙醇體積分數(shù)與電導率的變化關系是一致的，這應該與乙醇屬于非電解質的性質有關。

細胞的形態(tài)變化和細胞的氧化過程是循序漸進地進行的[23]，細胞形態(tài)在發(fā)酵60 h附近沒有出現(xiàn)突變現(xiàn)象，從而排除了細胞水平對電導率突變的干擾。由于乙醇體積分數(shù)是影響酒精發(fā)酵過程電導率的主要因素。當乙醇體積分數(shù)停止增加后，溶液中幾種重要陽離子質量濃度和h+質量濃度均保持上升趨勢，這些陽離子質量濃度的增加是導致電導率上升的主要原因，特別是h+質量濃度，它的變化速率與電導率的變化速率基本一致。

目前，盡管市場上已經存在乙醇體積分數(shù)測量儀，這些測量裝置運用了離線檢測技術[24]，或者運用了價格昂貴的膜技術或質譜技術[25]。而利用電導率儀在線測量電導率，不僅可以及時反映發(fā)酵過程乙醇體積分數(shù)的變化和酒精發(fā)酵終點的判斷，而且該方法操作簡單，儀器設備價格便宜，至于電導率的精確度問題還有待于通過建立數(shù)學模型或神經網絡來進一步校正。

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Change in Electrical Conductivity during Alcoholic Fermentation of Saccharified Corn Starch

LI Chongwei1,2, SONG Fuqiang2,*, SONG Yong1,2, SHEN Zhiwei1
(1. College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

The change of electrical conductivity, an initial increase followed by a decrease, during alcoholic fermentation of saccharified corn starch was observed in our previous work. This study further examined the effects of 4 main ions, reducing sugar, alcohol, cell concentration and pH on the variability of this parameter during the fermentation process. The results showed that all the above factors affected the change of electrical conductivity with alcohol concentration being the most important determinant. The decline of electrical conductivity was mainly due to the continuous increase of alcohol concentration in the fermented liquid. When alcohol concentration reached a plateau, electrical conductivity tended to increase as a result of a reduction in pH. Therefore, alcohol concentration had a direct impact on the change of electrical conductivity during the fermentation process. It is feasible to directly reflect the change of alcohol concentration by the change of electrical conductivity through the established mathematical model. The results could be applied for on-line monitoring alcoholic fermentation process and determining the end point of fermentation.

alcoholic fermentation; electrical conductivity; alcohol concentration; reduced sugar concentration

Q819

A

1002-6630（2015）21-0105-06

10.7506/spkx1002-6630-201521021

2015-05-05

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201412）；黑龍江省博士后資助項目（LBH-Z14206）；

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項基金項目（RC2012QN002095）

李沖偉（1977—），男，副教授，博士，主要從事酒精發(fā)酵過程的代謝控制及代謝產物研究。E-mail：chongweili@126.com

*通信作者：宋福強（1964—），男，教授，博士，主要從事菌根及生物廢棄物開發(fā)利用研究。E-mail：sfq1968@126.com