黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白成分的比較研究

鞠秀云，姜素平，劉金娟，袁 博，蔣繼宏

（江蘇師范大學 江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室，江蘇 徐州 221116）

黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白成分的比較研究

鞠秀云，姜素平，劉金娟，袁 博，蔣繼宏*

（江蘇師范大學 江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室，江蘇 徐州 221116）

為探究黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白成分的差異，采用研磨浸提、硫酸銨沉淀、凝膠柱層析的方法，獲得黑大蒜和鮮大蒜可溶性蛋白；采用阿爾瑪藍（Alamar Blue）法檢測其體外抗腫瘤活性，采用牛津杯法檢測其抗菌活性，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析其可溶性蛋白成分的差異。結果表明：從黑大蒜和鮮大蒜中提取的可溶性蛋白均具有抗人肝癌細胞株HepG2的活性，鮮大蒜中可溶性蛋白的抗腫瘤活性高于黑大蒜中可溶性蛋白的抗腫瘤活性，且具有耐熱性；鮮大蒜中可溶性蛋白還具有抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的活性，其分子質量在10～55 kD之間；黑大蒜中的可溶性蛋白不具有抗菌活性，其分子質量在10 kD左右。黑大蒜與鮮大蒜的可溶性蛋白在種類上差異較大，在抗人肝癌細胞株HepG2、抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的功能上差異顯著。

大蒜；可溶性蛋白；抗腫瘤；抗細菌活性

大蒜（Allium sativum L.）為百合科蔥屬多年生草本植物的地下鱗莖，具有抗菌消炎[1-2]、增強免疫力[3]、護肝[4]、防癌[5]、抗癌[6-7]、延緩衰老[8]、降低膽固醇水平[9]和降低心血管疾病風險[10-11]等多種功效。對于大蒜這些藥理活性的物質基礎目前研究較多的是含硫有機化合物[12-13]（主要包括蒜氨酸、大蒜素等）和大蒜多糖[14-15]。

黑大蒜是以新鮮的生大蒜為原料，經(jīng)過清洗、一定條件下較長時間的美拉德反應、干燥等過程加工而成的一種新型大蒜制品。它去除了大蒜的異味，帶有甜味、口感較好。研究表明黑大蒜中多種營養(yǎng)成分（如糖分、多酚、氨基酸）的含量增加了1 倍以上[16-17]，而作為美味成分的氨基酸、果糖的含量則比鮮大蒜增加了2.5 倍[18-19]；陳瀏丹[20]還對黑大蒜提取物對固有免疫細胞抗腫瘤活性的影響進行了相關研究。但目前對于大蒜中蛋白質的研究卻較少，僅魏雪盈等[21]從鮮大蒜中分離到兩種抗真菌活性蛋白，另有一些研究者采用凱氏定氮法測定了黑蒜總蛋白質的含量[22]。本實驗采用提取法將黑大蒜和鮮大蒜中的可溶性蛋白提取后進行檢測，比較其含量和相關活性差異，為人們正確理解黑大蒜和鮮大蒜的保健功能提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮大蒜 市售；黑大蒜 徐州綠之野生物食品有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室提供。

人肝癌細胞株HepG2，江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室提供。

Bradford蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術研究所；阿爾瑪藍（Alamar Blue）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、Tris、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、考馬斯亮藍R-250 美國Sigma公司；Bio-Gel P4 Gel 美國Bio-Rad公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

D37520型Heraeus Biofuge臺式高速離心機 德國Kendrc公司；CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶標儀 美國分子儀器公司；AKTA purifier快速純化系統(tǒng)（配有可變波長紫外檢測器、實時電導監(jiān)測器、樣品自動收集器和色譜工作站） 美國GE醫(yī)療集團。

1.3 方法

1.3.1 可溶性蛋白提取

硫酸銨沉淀：將樣品剪碎，加少量10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），充分研磨后，再加入兩倍體積磷酸鹽緩沖液，4 ℃條件下浸泡10 h以上。將浸提液4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入硫酸銨固體到80%飽和度，4 ℃靜置過夜，12 000 r/min離心30 min，收集沉淀，溶于10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），得到可溶性蛋白粗提液，－20 ℃保存。

凝膠柱層析脫鹽脫色：取上述可溶性蛋白粗提液，上樣到平衡好的Bio-Gel P4 Gel柱（1.5 cm×27 cm，45～90 μm），用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，紫外檢測器波長280 nm，按峰收集洗脫液。

1.3.2 可溶性蛋白含量測定

采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進行，以牛血清白蛋白為標準樣品。

1.3.3 抗腫瘤細胞活性測定

采用Alamar Blue法檢測樣品可溶性蛋白的體外抗腫瘤活性。將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞，用完全培養(yǎng)基制成2×105個/mL的懸液，用微量加樣器接種于96 孔板中，每孔100 μL，邊緣孔中不加細胞，僅加完全培養(yǎng)基作為無細胞空白組，（37.0±0.5） ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。每孔加一定量樣品，再用完全培養(yǎng)基補加至100 μL；同時留數(shù)孔不加樣品，補加完全培養(yǎng)基100 μL，作為空白對照組。相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔用200 μL基本培養(yǎng)基洗一次，傾去，每孔再加入基本培養(yǎng)基180 μL、Alamar Blue 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于激發(fā)光波長530 nm、發(fā)射光波長590 nm處檢測并記錄熒光強度，按下式計算樣品對HepG2細胞的抑制率。

1.3.4 抗細菌活性測定

采用牛津杯法（管碟法）測定樣品的抑菌活性：將滅好菌的LB培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，倒入培養(yǎng)皿內，每皿約15 mL，水平放置至其完全凝固，取0.2 mL制備好的菌懸液（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）在平板上均勻涂布，涂布后以平板無可見水滴為準。用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，每皿均勻地放置3 支牛津杯。取樣品液0.20 mL加至牛津杯中，每一個樣品重復3 次，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察記錄實驗結果。

1.3.5 分子質量范圍測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）測定黑大蒜和鮮大蒜中可溶性蛋白的分子質量，其中分離膠中丙烯酰胺總含量為15%；濃縮膠中丙烯酰胺總含量為5%，其中交聯(lián)的丙烯酰胺占2.6%，考馬斯亮藍法染色[23]。

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白提取結果

鮮大蒜和黑大蒜經(jīng)研磨浸提、硫酸銨沉淀、Bio-Gel P4 Gel柱層析后，獲得可溶性蛋白，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定每步提取后的可溶性蛋白含量，計算純度和回收率，具體結果見表1。

表1 鮮大蒜和黑大蒜中可溶性蛋白提取結果Table 1 Isolation of soluble proteins from black garlic and fresh garlic

分析表1的提取結果發(fā)現(xiàn)，黑大蒜中提取到的可溶性蛋白比鮮大蒜中略低；而有些文獻報道，黑大蒜中的蛋白質含量為鮮大蒜中的2 倍。造成這種差異的原因是獲取蛋白的方法不同，文獻中普遍采用凱氏定氮法測定蛋白質含量，而非直接測定可溶性蛋白含量。

2.2 可溶性蛋白的抗腫瘤細胞活性

將鮮大蒜和黑大蒜的研磨浸提液和Bio-Gel P4 Gel柱層析后的收集液用水配制成可溶性蛋白含量為1 mg/mL的樣品溶液，同時取一定量上述溶液進行95 ℃、5 min的加熱處理，將制備好的樣品再用細胞培養(yǎng)基進行1∶10、1∶20、1∶40稀釋，測定其抗腫瘤細胞活性，具體結果見表2。

表2 鮮大蒜和黑大蒜中可溶性蛋白抗腫瘤細胞活性比較Table 2 Comparison of antitumor activity of soluble proteins from black garlic and fresh garlic

分析表2數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，當質量濃度為1 mg/mL的各樣品1∶10稀釋后，均表現(xiàn)出很高的抑制人肝癌細胞株HepG2的活性，這說明鮮大蒜和黑大蒜的可溶性蛋白均具有抗腫瘤細胞的活性；但隨著溶液稀釋倍數(shù)的增大，各樣品表現(xiàn)出了不同程度的抑制腫瘤細胞活性，當稀釋倍數(shù)為1∶40時，鮮大蒜柱層析液仍表現(xiàn)出較高的抑制人肝癌細胞株HepG2的活性（加熱前樣品的抑制率為84.1%，加熱后樣品的抑制率為81.7%），經(jīng)相同條件處理的黑大蒜提取液則沒有活性。由此可以推斷，鮮大蒜中的可溶性蛋白抑制人肝癌細胞株HepG2的活性高于黑大蒜，而且具有耐熱性。

從表2的數(shù)據(jù)中還可以發(fā)現(xiàn)，樣品稀釋倍數(shù)增加后，加熱后的鮮大蒜浸提液抗腫瘤細胞活性快速下降（1∶40稀釋時對HepG2的抑制率為－0.4%），而較純的蛋白樣品，即鮮大蒜柱層析液加熱后活性降低較慢，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是浸提液中的其他成分在加熱條件下對可溶性蛋白有破壞作用，這與黑大蒜的可溶性蛋白抗腫瘤活性低于鮮大蒜的結果相一致。黑大蒜是由鮮大蒜在高濕高溫的條件下生產(chǎn)得到的[24]，在此過程中部分具有抗腫瘤活性的可溶性蛋白被降解，從而導致其抗腫瘤活性低于鮮大蒜。

2.3 可溶性蛋白的抗細菌活性

將從鮮大蒜和黑大蒜中提取的可溶性蛋白配制成1 mg/mL的溶液，同時取一定量上述溶液進行95 ℃、5 min的加熱處理，將上述樣品分別進行抗大腸桿菌和抗金黃色葡萄球菌的實驗，結果如圖1～3所示。

圖1 鮮大蒜中可溶性蛋白對大腸桿菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of soluble proteins from fresh garlic on Escherichia coli

圖2 鮮大蒜中可溶性蛋白對金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of soluble proteins from fresh garlic on Staphylococcus aureus

由圖1、2可知，鮮大蒜的可溶性蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，但加熱后抑菌活性基本消失，這說明鮮大蒜中具有抗菌活性的可溶性蛋白不具有耐熱性。由圖3可知，黑大蒜的可溶性蛋白沒有抑菌活性。

圖3 黑大蒜中可溶性蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of soluble proteins from black garlic on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.4 可溶性蛋白分子質量范圍

將經(jīng)過Bio-Gel P4 Gel柱層析獲得的可溶性蛋白配成2 mg/mL的溶液，取20 μL進行SDS-PAGE分析，結果顯示鮮大蒜的可溶性蛋白分子質量主要在10～55 kD范圍內（圖4中2號條帶），而黑大蒜的可溶性蛋白分子質量主要在10 kD左右（圖4中3號條帶）。這說明鮮大蒜經(jīng)高溫高濕的等工藝生產(chǎn)得到黑大蒜，在此過程中蛋白質發(fā)生了降解，使得黑大蒜中可溶性蛋白分子質量明顯低于鮮大蒜。

圖4 鮮大蒜和黑大蒜可溶性蛋白的SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE of soluble proteins from black garlic and fresh garlic

3 討 論

大蒜是著名的藥食兩用植物，具有多種生物活性[25]。隨著人們對自身健康的重視以及對天然藥食的青睞，已圍繞大蒜開發(fā)出多種保健食品，如大蒜粉、大蒜油、大蒜飲料、脫水大蒜等[26-27]，其中黑大蒜因去除了原來的辣味且略帶果香味、營養(yǎng)成分豐富而備受人們的喜愛。有關鮮大蒜和黑大蒜營養(yǎng)成分的研究也受到了人們的重視。張鑫等[28]比較了黑大蒜和鮮大蒜提取物對小鼠細胞免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)黑大蒜提取物較鮮大蒜提取物有更強的自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性和促NO、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌的作用；二者對IL-4的分泌水平無影響。王衛(wèi)東等[29]對黑大蒜在生產(chǎn)過程中的營養(yǎng)成分變化和抗氧化活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)黑大蒜中的水分含量相較于鮮大蒜有所下降；還原糖、總酸、總酚含量相較于鮮大蒜有所上升，黑大蒜的還原能力、羥自由基清除率分別是鮮大蒜的10 倍和3 倍。由此得出黑大蒜抗氧化能力的增強在一定程度上與其含有的總酚和美拉德反應產(chǎn)物含量增加有關的結論。

在對于蛋白質含量的變化研究中，研究者普遍采用凱氏定氮法測定，得出黑大蒜蛋白含量比鮮大蒜增加了1 倍左右的結論。凱氏定氮法測定的是樣品中總氮元素的含量，是間接測定樣品中蛋白質含量的一種方法。鮮大蒜經(jīng)過較長時間的美拉德反應后，一些蛋白質會發(fā)生變化，可能會使原本的蛋白氮變成非蛋白氮。因此，僅通過比較黑大蒜和鮮大蒜中的總蛋白含量來評估兩者的優(yōu)劣不夠全面和科學。本研究將樣品中的可溶性蛋白提取后進行測定，比較其含量和相關活性的差異。結果發(fā)現(xiàn)，黑大蒜中的可溶性蛋白分子質量遠低于鮮大蒜，這說明經(jīng)過美拉德反應后，高分子質量的蛋白質降解為低分子質量的蛋白質，甚至是氨基酸。蛋白質分子質量的降低有利于人體腸道的消化吸收，對于胃腸道功能較弱的人，食用黑大蒜更有利。然而隨著蛋白質分子質量的改變，其功效也發(fā)生了改變，黑大蒜中可溶性蛋白的體外抗腫瘤活性、抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性有所下降。本研究結果為人們理解黑大蒜和鮮大蒜的保健功能和正確食用兩類食品提供了實驗依據(jù)。

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Comparison of Soluble Protein Components of Black Garlic and Fresh Garlic

JU Xiuyun, JIANG Suping, LIU Jinjuan, YUAN Bo, JIANG Jihong*
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China)

The aim of this study was to compare the difference of soluble protein components isolated from black garlic and fresh garlic. Soluble proteins were isolated from garlic by serial extraction methods including grinding, ammonium sulfate precipitation and gel filtration. Then, the antitumor activities of the extracts were determined in vitro using alamar blue method; the antibacterial activities were detected by oxford cup assay; and the differences of soluble protein components were further compared using SDS-PAGE. The results showed that the soluble protein components from both fresh garlic and black garlic were able to inhibit the growth of HepG2 cells. The soluble protein components from fresh garlic had stronger antitumor activity than those from fresh garlic and had heat resistance property. The soluble protein components from fresh garlic could inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus. SDS-PAGE results showed that the molecular weight of soluble proteins in fresh garlic was in the range from 10 to 55 kD, and was about 10 kD for black garlic. This study indicated that there were significant differences in soluble protein species and functions between black garlic and fresh garlic.

garlic; soluble protein; antitumor; antibacterial activity

TS255.1

A

1002-6630（2015）21-0090-05

10.7506/spkx1002-6630-201521018

2014-12-31

徐州市科技計劃項目（XF13C036）

鞠秀云（1973—），女，高級實驗師，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：juxiuyun@jsnu.edu.cn

*通信作者：蔣繼宏（1962—），男，教授，博士，研究方向為藥用植物生物技術。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn