囊性纖維化疾病調(diào)節(jié)劑的研究進(jìn)展

王新穎，劉冬青

（青島科技大學(xué)，山東青島266042）

囊性纖維化疾病調(diào)節(jié)劑的研究進(jìn)展

王新穎，劉冬青

（青島科技大學(xué)，山東青島266042）

囊性纖維化是在白種人中最常見(jiàn)的危及生命的常染色體隱性遺傳病，由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子基因突變引起，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子也因此成為藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。按引發(fā)囊腫性纖維化的原因，可將囊腫性纖維化突變分為五類(lèi)。本文主要介紹治療前三類(lèi)基因突變的調(diào)節(jié)劑，這些制劑為囊性纖維化患者帶來(lái)了福音。

囊性纖維化；囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子；調(diào)節(jié)劑

1 介紹

1.1 CFTR突變的分類(lèi)

囊性纖維化（CF）是由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因突變引起的遺傳性疾病。CFTR可在轉(zhuǎn)錄、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、通道開(kāi)放水平上影響蛋白質(zhì)的生物合成與活性。CFTR氯離子和碳酸氫根離子電導(dǎo)活性的缺乏會(huì)降低上皮層頂端表面的水和pH，導(dǎo)致粘液積聚在胰腺、腸、睪丸、肝和肺中[1]。肺部感染和發(fā)炎是囊性纖維化發(fā)病和死亡的主要原因[2]。

在CFTR中存在超過(guò)1900種引發(fā)囊性纖維化的突變，我們將其分為五類(lèi)[3]。Ⅰ類(lèi)突變（CF患者中的10%）阻礙了CFTR蛋白的合成。Ⅱ類(lèi)突變（CF患者中的70%）抑制了CFTR蛋白的折疊和穩(wěn)定性，使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中降解，阻止了其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。Ⅱ類(lèi)突變的共同特征是Phe508的缺失造成的。Ⅲ類(lèi)突變（CF患者中的2%～3%）是門(mén)控突變，正常轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面但通道活性降低。Ⅳ類(lèi)突變（＜2%）降低了通過(guò)蛋白通道的離子的電導(dǎo)率。Ⅴ類(lèi)突變（＜1%）一般存在剪接缺陷，降低了CFTR蛋白的表達(dá)而沒(méi)有改變氨基酸序列[4]。Ⅳ、Ⅴ類(lèi)突變比前三類(lèi)突變的臨床癥狀要緩和[5]。

不同類(lèi)型的突變有不同的治療策略。促進(jìn)識(shí)別終止密碼子的化合物，可從mRNA合成功能CFTR，從而治療一類(lèi)突變。通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)表面的水平或直接作用于錯(cuò)誤折疊的CFTR蛋白或改善蛋白質(zhì)的折疊環(huán)境可治療二類(lèi)突變。通過(guò)改善蛋白表面的通道活性可治療三類(lèi)突變。這些化合物通常根據(jù)它們治療主要蛋白缺陷的能力來(lái)分類(lèi)，但這些制劑也可聯(lián)合使用以增強(qiáng)療效。

1.2 細(xì)胞分析

利用工程細(xì)胞系對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選來(lái)鑒別突變CFTR調(diào)節(jié)劑。這類(lèi)細(xì)胞系已經(jīng)成功用于鑒別校正劑和增效劑。這種細(xì)胞系通常被設(shè)計(jì)為表達(dá)CFTR的突變形式，特別是F508del。通過(guò)分析膜蛋白的改變或?qū)u化物敏感的熒光蛋白受體熒光淬滅的增強(qiáng)來(lái)測(cè)量依賴(lài)于F508delCFTR的離子電導(dǎo)率。

最近，從F508del和其它引起突變的患者體內(nèi)分離得到了腸細(xì)胞組織體，并已經(jīng)得到了一種不依賴(lài)突變CFTR外源表達(dá)的細(xì)胞體系，該體系對(duì)化合物庫(kù)的篩選是一種有益的新方法。

CFTR突變的病理生理學(xué)后果在肺部最嚴(yán)重，肺細(xì)胞是評(píng)估表型解救的黃金標(biāo)準(zhǔn)。分離的原代人支氣管上皮細(xì)胞(HBEs),在氣-液界面處是分化的，氣液界面處充分再現(xiàn)了其天然環(huán)境以至于在體外用分化良好的細(xì)胞可以觀測(cè)到協(xié)調(diào)的纖毛跳動(dòng)和黏液產(chǎn)量。在尤斯灌流室中用HBEs進(jìn)行電生理學(xué)研究直接提供了內(nèi)源性突變CFTR氯化物的電導(dǎo)活性的測(cè)量。

應(yīng)用功能分析去得到構(gòu)效關(guān)系再得到臨床候選藥物，說(shuō)明了用表型篩選去發(fā)現(xiàn)藥物的價(jià)值。

1.3 調(diào)整呼吸道表面液體缺陷的其他策略

這篇文章主要討論利用小分子通過(guò)提高蛋白質(zhì)表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)或增強(qiáng)它的開(kāi)放來(lái)校正CFTR功能。雖然基因治療能有效治療任何CFTR突變，但用此方法需要克服人體的免疫防衛(wèi)，這是一大挑戰(zhàn)。在CF患者呼吸道內(nèi)減少水分和嚴(yán)重的炎癥已經(jīng)成為治療目標(biāo)。一些有效治療CF疾病的方法包括：通過(guò)抑制上皮細(xì)胞鈉通道（ENaC）來(lái)阻斷鈉吸收（GS9411, GS5737，picolinamides）,通過(guò)離子載體刺激激活的氯化鈣通道，通過(guò)P2Y2受體（denufosol）感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平以及使用抗炎劑(BIIL 284 BS，CTX-4430)[6]。

2 治療一類(lèi)缺陷

2.1 Ataluren(PTC124，圖1)

圖1

Ataluren是一種通讀制劑，可抑制PTCs，恢復(fù)功能蛋白生產(chǎn)[7,8]，但它的作用機(jī)制一直存在爭(zhēng)議。Ataluren在一類(lèi)突變的CF患者中進(jìn)行測(cè)試，患者的一秒用力呼氣容積（FEV1）提升了約3%。亞群分析顯示，沒(méi)有用氨基糖苷類(lèi)抗生素治療的患者的FEV1提升了6%[9]，目前Ataluren正在沒(méi)有用氨基糖苷類(lèi)抗生素治療的患者中進(jìn)行三期臨床試驗(yàn)。

2.2 NB124(圖2)

圖2

NB124[10]是一類(lèi)合成氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)去除調(diào)節(jié)抗菌作用的結(jié)構(gòu)成分而保留促進(jìn)PTCs通讀的成分設(shè)計(jì)得到。對(duì)一類(lèi)突變非常有效，比第一代化合物的治療指數(shù)強(qiáng)10倍，與Ivacaftor(一種增效劑，Compound 12)聯(lián)合使用可進(jìn)一步增強(qiáng)其活性。

3 治療二類(lèi)缺陷（校正劑）

校正劑是幫助二類(lèi)突變的CFTR克服折疊、穩(wěn)定性、降解而到達(dá)細(xì)胞表面的化合物。最常見(jiàn)的CFTR突變是F508del突變。二類(lèi)突變占所有CFTR突變的70%。調(diào)查顯示，87%的CF患者至少有一個(gè)F508del，47%是純合子，40%是F508del結(jié)合另一引起CF突變的雜合子。最近的研究提供了一些校正F508del折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)劑[11]。治療策略包括用藥理學(xué)分子伴侶直接修正F508delCFTR[12]，增強(qiáng)折疊環(huán)境，調(diào)整由于增強(qiáng)突變蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性而造成的細(xì)胞壓力。校正CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物在其它蛋白質(zhì)折疊/轉(zhuǎn)運(yùn)疾病中也顯示出了療效。

3.1 VX-809(圖3)

圖3

在原發(fā)性患者的F508del/F508del人支氣管上皮細(xì)胞（HBEs）中，校正劑VX-809使氯離子流量提高到非CF患者HBEs的14%，Ivacaftor可達(dá)到9%，兩者結(jié)合使用可達(dá)到25%。VX-809最可能是一種藥物分子伴侶，穩(wěn)定蛋白質(zhì)突變體的NBD1域和第一個(gè)跨膜域(MSD1)的相互作用。

在臨床試驗(yàn)中，純合子的F508del患者，單獨(dú)用單劑量的VX-809或Ivacaftor都不能顯著提高FEV1，而兩者聯(lián)合使用可使FEV1提高2.8%～3.3%。

3.2 VX-661(圖4）

VX-661是第二個(gè)F508delCFTR校正藥物，目前正在進(jìn)行臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)。它協(xié)助CFTR蛋白到達(dá)細(xì)胞表面，使F508delCFTR突變通道避免降解且轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上。在原發(fā)性患者的F508del/F508del HBEs中，校正劑VX-661使氯離子流量提高到非CF患者HBEs的9%，Ivacaftor也可達(dá)到9%，兩者結(jié)合使用可達(dá)到26%。

3.3 407882(圖5)

用DOCK程序?qū)508delNBD1進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，得到了新的F508del轉(zhuǎn)運(yùn)校正劑[13]。它干擾NBD1和角蛋白8的相互作用，1μM就可使F508delHBEs活性達(dá)到非CF患者HBE活性的15%。

圖4

圖5

3.4 Matrine(圖6)

圖6

分子伴侶質(zhì)量控制通路的調(diào)節(jié)也是校正有缺陷的CFTR折疊的一種有效策略。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿（Matrine）[14]抑制分子伴侶Hsc70從ER釋放F508del?CFTR到細(xì)胞表面，致使在細(xì)胞表面有比較高的F508del蛋白水平。

3.5 Apoptozole(圖7)

圖7

Apoptozole[15]結(jié)合Hsc70和Hsp70，解離常數(shù)分別為0.21μM和0.14μM。該化合物通過(guò)阻礙突變體與Hsc70分子伴侶和泛素化連接酶的相互作用來(lái)抑制F508delCFTR的泛素化，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞表面的穩(wěn)定性。在F508del-CFTR表達(dá)的人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞（HEK）中，200nM的Apoptozole使氯離子通道活性達(dá)到野生型CFTR(wt-CFTR)表達(dá)細(xì)胞的20%。

3.6 Latonduine A(圖8)

圖8

通過(guò)篩選太平洋海洋海面提取物發(fā)現(xiàn)了可修正F508del錯(cuò)誤折疊的校正劑Latonduines，使CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高到wt-CFTR表面表達(dá)的45%[16]。

3.7 激酶抑制劑

在激酶抑制劑化合物庫(kù)中篩選得到可以恢復(fù)F508delCFTR活性的化合物，研究顯示，以FGFR/ FEGFR/PDGFR為靶點(diǎn)的激酶抑制劑SU5402,以及以Ras/Raf/MEK/ERK/p38,和GSK-3β為靶點(diǎn)的激酶抑制劑kenpaullone可使F508del恢復(fù)到wt-CFTR 的10%～30%。

3.8 其它校正劑

研究表明蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑單獨(dú)使用在HBEs中有活性，也可與其它校正劑聯(lián)合使用來(lái)增強(qiáng)校正劑的療效。四環(huán)素通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)環(huán)境來(lái)發(fā)揮校正作用。Ambroxol可提高CF患者細(xì)胞內(nèi)CFTR 和ENaC表達(dá)以及氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 治療三類(lèi)缺陷（增效劑）

4.1 VX-770(圖9)

Ivacaftor是第一個(gè)獲批的治療CF的制劑，他在2012年1月被批準(zhǔn)治療G551D突變的患者（占CF患者的4.3%）[17]。來(lái)自PERSIST的數(shù)據(jù)分析顯示，用Ivacaftor進(jìn)行了144周的持續(xù)治療，其可在肺功能（FEV1提高了6%）、體重等方面持續(xù)發(fā)揮作用。

圖9

4.2 RP193(圖10)

圖10

有研究報(bào)道，CDK/GSK-3β抑制劑RP193可校正F508del，它對(duì)野生型、F508del和G551D CFTR都有效。吡咯并[2,3-b]吡嗪系列化合物的構(gòu)效關(guān)系表明，RP193使CFTR增強(qiáng)的同時(shí)有較低的毒性。

4.3 其他的增效劑

已經(jīng)報(bào)道的其他的增效劑還有白藜蘆醇、去氫木香內(nèi)酯和Dihydropyridines。

5 有雙重活性的化合物

為了充分優(yōu)化F508delCFTR的功能活性，必須既校正轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，又增強(qiáng)在細(xì)胞表面的通道開(kāi)放。為此可將校正劑與增效劑聯(lián)合使用或者尋找有這兩種活性的化合物。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有校正劑和增效劑雙重活性的化合物，可在一次治療中同時(shí)改善兩種功能缺陷。此外，一些有抗炎活性的化合物也同時(shí)具有F508del CFTR校正劑和增效劑的活性。

5.1 N6022

研究表明，S-亞硝基谷胱甘肽還原酶（GSNOR）抑制劑同時(shí)具有抗炎、CFTR校正劑和增效劑活性，它作用于Hsp70/Hsp90組織蛋白(Hop)通道而發(fā)揮作用。N6022是一種GSNOR抑制劑，IC50為8nM，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于F508delCFTR患者[18]。

5.2 CoPo-22

氰基喹啉類(lèi)化合物CoPo-22通過(guò)高通量篩選得到[19]。研究顯示，此化合物既可只做校正劑或增效劑，也可同時(shí)具有這兩種活性。分子建模顯示在氰基喹啉和芳香酰胺間的柔性鏈和相對(duì)較短的連接是重要的CoPo特性。

5.3 Hyalout4(圖11)

圖11

CFTR不僅生成天然水化物也生成透明質(zhì)酸。Hyalout4以二芳基類(lèi)似物為基礎(chǔ)，模仿透明質(zhì)酸鏈的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，從而增強(qiáng)了膜滲透性，既可用作F508delCFTR校正劑，也可用作增效劑[20]。

6 結(jié)論

治療囊性纖維化能延長(zhǎng)此病患者的壽命，改善患者的生活質(zhì)量，如今，囊性纖維化患者的壽命已由28歲延長(zhǎng)到了38歲。然而，從意識(shí)到CFTR基因缺陷到第一個(gè)制劑上市花費(fèi)了28年。對(duì)由CFTR門(mén)控突變引發(fā)的三類(lèi)說(shuō)明了用小分子治療CF的可能，但仍需要開(kāi)發(fā)大量藥物來(lái)治療二類(lèi)CF，Ivacaftor的上市說(shuō)明了用小分子治療CF的可能，但仍需要開(kāi)發(fā)大量藥物來(lái)治療二類(lèi)CF，探索多種校正多元缺陷的方法。這些策略的聯(lián)合使用是治療F508delCF的成功方法，有希望治愈所有的CF患者。

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·信息·

“皮塑廢棄物粉體相容增強(qiáng)關(guān)鍵技術(shù)及其循環(huán)應(yīng)用”榮獲浙江省科技二等獎(jiǎng)

在浙江省政府召開(kāi)全省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)大會(huì)上，浙江豐利粉碎設(shè)備有限公司和寧波工程學(xué)院合力研發(fā)的“皮塑廢棄物粉體相容增強(qiáng)關(guān)鍵技術(shù)及其循環(huán)應(yīng)用”項(xiàng)目榮獲技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)。該項(xiàng)目有效實(shí)現(xiàn)了皮塑廢棄物粉碎裝備產(chǎn)業(yè)化，皮粉增強(qiáng)橡膠制品生產(chǎn)以及回收塑料的再生資源化利用等，取得了良好的社會(huì)和生態(tài)效益。

浙江豐利攜手寧波工程學(xué)院，從2007年開(kāi)始產(chǎn)學(xué)研合作，合力攻關(guān)皮革廢棄物資源化利用課題，共同承擔(dān)的“皮革廢棄物用作橡塑填充材料技術(shù)開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化”項(xiàng)目列入浙江省2008年度第一批重大科技專(zhuān)項(xiàng)。為進(jìn)一步推進(jìn)這一工程，又于2009年8月1 8日成立了“廢棄生物質(zhì)資源化及裝備工程技術(shù)中心”。2013年7月，該項(xiàng)目在寧波工程學(xué)院首次通過(guò)教育部科技成果鑒定。通過(guò)近10年的不懈努力，終于突破了粉碎裝置和相容增強(qiáng)等關(guān)鍵技術(shù)，并實(shí)現(xiàn)了多項(xiàng)產(chǎn)品的循環(huán)應(yīng)用。該項(xiàng)目共發(fā)表學(xué)術(shù)論文48篇，其中SCI/EI論文13篇；獲得授權(quán)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利5件，授權(quán)實(shí)用新型專(zhuān)利5件，申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利9件。該項(xiàng)成果在固體廢棄物的循環(huán)利用方面獲得了多項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)，在皮/塑廢棄物綜合利用及其復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。

項(xiàng)目實(shí)施以來(lái)，已在江浙滬等省市推廣應(yīng)用，有效減量消耗處理廢塑料、廢棄皮革等固廢，使之變廢為寶，促進(jìn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，改善人們居住環(huán)境生態(tài)條件，保證環(huán)境生態(tài)文明，樹(shù)立良好形象提供強(qiáng)有力的地支撐。

（吳紅富）

10.3969/j.issn.1008-1267.2015.04.002

TQ463+.5

A

1008-1267（2015）04-0004-05

2015-03-18