N摻雜改性P25抑菌材料的制備及其可見(jiàn)光催化抑菌活性的研究*

李瑩影，宋賢良，張靜

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東廣州，510642)

我國(guó)果蔬的品種和產(chǎn)量均居世界之首，然而因保鮮技術(shù)落后，每年造成大量的果蔬腐爛變質(zhì)，經(jīng)濟(jì)損失巨大［1］。因此，探尋高效的果蔬貯藏保鮮新技術(shù)一直是人們研究的熱點(diǎn)。采后果蔬在貯藏過(guò)程中易受微生物侵染，發(fā)生生理和化學(xué)敗壞是導(dǎo)致其腐爛變質(zhì)的主要原因［2］。納米TiO2作為一種新型的光催化抗菌材料，具有廣譜抗菌性能以及良好的阻隔和力學(xué)性能，在貯藏保鮮方面具有潛在的應(yīng)用前景［3-7］。

但是納米TiO2只有在紫外光激發(fā)下才表現(xiàn)出較強(qiáng)的光催化抗菌活性，使其在果蔬保鮮中的應(yīng)用受到限制［8-10］。研究表明，非金屬元素?fù)诫s改性能夠?qū)iO2的光響應(yīng)范圍拓寬到可見(jiàn)光區(qū)域［11-13］，增強(qiáng)其對(duì)可見(jiàn)光的利用效率，從而提高材料的光催化性能，其中N摻雜被認(rèn)為是一種有效的方法［14-15］。

本研究以商業(yè)納米TiO2(P25)為材料，采用非金屬元素N進(jìn)行摻雜改性以提高其可見(jiàn)光響應(yīng)活性，詳細(xì)研究了改性P25-N粉體對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。通過(guò)研究既能為果蔬貯藏保鮮技術(shù)開(kāi)辟新的途徑，又能為具有抗菌功能的新型保鮮材料的研究開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑:大腸桿菌(Escherichia coli，O78，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室)，P25(德國(guó)Degussa公司)，脲、乙醇、NaOH(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。

主要儀器:座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(DX-35BI)，上海申安醫(yī)療器械廠;生化培養(yǎng)箱(LRH-250A)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;真空煅燒爐(SK-G014143)，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;水浴恒溫振蕩器(SHA-C)，金山市華峰儀器有限公司;752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;光催化抑菌反應(yīng)器，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)械實(shí)驗(yàn)室。

1.2 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照本課題組張靜等所采用的方法［16］:用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法得出搖床培養(yǎng)的新鮮菌液的菌濃度，將其按10倍稀釋法得到一系列已知菌濃度的菌懸液樣品，在600 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各樣品的OD值，以光密度(OD值)為橫坐標(biāo)，以菌濃度(CFU/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 N摻雜P25(N-P25)抑菌材料的制備

稱取定質(zhì)量的P25粉末于瑪瑙研缽中，再加入一定量的脲粉末，將二者研磨混合，至于80℃烘箱過(guò)夜，轉(zhuǎn)移真空煅燒爐中，在設(shè)定的溫度與時(shí)間下煅燒，冷卻后取出，研磨得淡黃色粉末。

在煅燒溫度為400℃，煅燒3 h的條件下，按上述的方法制備2 g P25粉體脲摻雜量分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g 的改性 N-P25抑菌材料。

在煅燒時(shí)間為3 h，2 g P25摻雜8 g脲的條件下，按上述的方法制備煅燒溫度分別為350，400，450，500，550，600 ℃的改性 N-P25抑菌材料。

在煅燒溫度為400℃，2g P25摻雜8g脲的條件下，按上述的方法制備煅燒時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h 的改性 N-P25抑菌材料。

1.4 可見(jiàn)光催化抑菌活性測(cè)定

在嚴(yán)格保證無(wú)菌條件下，在超凈工作臺(tái)中將1 mL 105CFU/mL的菌懸液與1 mL生理鹽水加入8 mL生理鹽水試管中作為空白對(duì)照組，將1 mL 105CFU/mL的菌懸液與1 mL 1.0 g/L改性光催化劑懸濁液加入8 mL生理鹽水試管中作為實(shí)驗(yàn)組。將其置于渦流振蕩器中，振蕩使其混勻，再將其轉(zhuǎn)移至的光催化抑菌反應(yīng)器中進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。反應(yīng)器光源為85WE27-白光6 400 K普通熒光燈，開(kāi)始光照并計(jì)時(shí)，每隔20 min取樣100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基平板中(分別做3個(gè)平行)，倒置恒溫培養(yǎng)(細(xì)菌37℃培養(yǎng))，計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算抑菌率。抑菌率計(jì)算:

式中，K-抑菌率;C0-空白對(duì)照組光照后存活的菌量;C-實(shí)驗(yàn)組光照后存活的菌量。

1.5 N摻雜改性P25抑菌材料滅活大腸桿菌二次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了3因素3水平的二次旋轉(zhuǎn)回歸實(shí)驗(yàn)，以可見(jiàn)光條件下N-P25改性抑菌材料對(duì)大腸桿菌抑菌效果為考察指標(biāo)，對(duì)N-P25改性抑菌材料的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。中心組合實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table 1 Factors associated with the level of response surface analysis table

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線

見(jiàn)本課題組張靜等所作的標(biāo)曲［16］，以光密度(OD值)為橫坐標(biāo)，以菌濃度(CFU/mL)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得回歸方程為:y=2×109X-2×108，R2=0.999 5，說(shuō)明線性擬合程度良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 脲摻雜量對(duì)N摻雜改性P25材料可見(jiàn)光催化抑菌活性的影響

由圖1可知，隨著脲摻雜量的增加，N-P25材料抑菌率先呈上升趨勢(shì)，在脲摻雜量為2～8 g/g P25，抑菌率快速提高，但當(dāng)脲摻雜量大于8 g/g P25后，抑菌率幾乎沒(méi)變，故取最佳脲摻雜量8 g/g P25。這可能由于摻雜濃度較高時(shí)，有利于生成新的電子-空穴的復(fù)合中心，增大其復(fù)合幾率［17］;而過(guò)高的摻雜濃度有可能使N元素在TiO2中達(dá)到飽和而產(chǎn)生新相［18］，減少TiO2有效表面積和對(duì)光的吸收，從而降低光催化效率。

圖1 不同硫脲摻雜量下改性P25-N材料的抑菌率Fig.1 Antibacterial rate of modified P25-N material in different thiourea doping amount

2.2.2 煅燒溫度對(duì)N摻雜改性P25材料可見(jiàn)光催化抑菌活性的影響

由圖2可知，N-P25材料抑菌率隨煅燒溫度的升高呈逐漸增加的趨勢(shì)，在550℃抑菌率最高。高溫煅燒使更多的N元素?fù)饺攵趸伨w中，形成雜質(zhì)置換缺陷，這個(gè)置換缺陷的存在可擴(kuò)大激發(fā)波長(zhǎng)的范圍，提高光催化反應(yīng)效率，從而提高N-P25材料抑菌率。550℃以后，N-P25材料抑菌率隨著溫度的升高開(kāi)始下降，這是因?yàn)榧{米二氧化鈦部分銳鈦礦晶型轉(zhuǎn)化為金紅石晶型。摻雜元素的存在會(huì)影響溫度對(duì)TiO2晶型轉(zhuǎn)化的作用，這可能是導(dǎo)致煅燒溫度對(duì)N-P25材料抑菌率產(chǎn)生不同影響的原因［19］。

圖2 不同煅燒溫度下改性P25-N材料的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of modified P25-N material at different calcining temperature

2.2.3 煅燒時(shí)間對(duì)N摻雜改性P25材料可見(jiàn)光催化抑菌活性的影響

由圖3可知，隨著煅燒時(shí)間的增加，N-P25材料的抑菌率呈先升高后降低趨勢(shì)，煅燒時(shí)間為1.5 h時(shí)NP25材料的抑菌率最高。這是因?yàn)槎虝r(shí)間的煅燒可以提供適當(dāng)?shù)膭?dòng)能加速分子無(wú)序運(yùn)動(dòng)從而使得N元素?fù)饺攵趸伨w中，而長(zhǎng)時(shí)間的煅燒會(huì)提供過(guò)量的熱能使得摻入二氧化鈦晶體中N元素部分逸出，減少二氧化鈦晶體中N元素?fù)诫s量。另外，煅燒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致TiO2的銳鈦礦相和金紅石相晶體粒徑不同程度的增大［20］。

圖3 不同煅燒時(shí)間下改性P25-N材料的抑菌率Fig.3 Antibacterial rate of modified P25-N material at different calcining time

2.2.4 空白對(duì)照試驗(yàn)

由圖4可知，隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)，無(wú)光照組和空白組大腸桿菌菌落數(shù)無(wú)明顯變化，而P25抑菌材料的抑菌率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，最高可達(dá)79%。表明P25材料只有在光照條件下才能發(fā)揮抑菌性，光能激發(fā)是P25發(fā)揮抑菌性的必要條件。

圖4 P25抑菌材料在可見(jiàn)光下對(duì)大腸桿菌的抑菌性Fig.4 Antibacterial rate of P25material in the visible light

由圖5可知，隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)，無(wú)光照組和空白組大腸桿菌菌落數(shù)無(wú)明顯變化，而N-P25材料組的抑菌率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，其在可見(jiàn)光條件下對(duì)大腸桿菌的抑菌率最高可達(dá)90%，相對(duì)P25在可見(jiàn)光條件下79%的抑菌率有較大的改善，這表明采用研磨煅燒法用脲對(duì)P25材料進(jìn)行改性可提高材料抑菌率。

圖5 不同材料在可見(jiàn)光下的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of different material in the visible light

2.3 二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)抑菌材料制備工藝中的煅燒溫度A、煅燒時(shí)間B和脲摻雜量C三個(gè)因素做二次旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 改性P25-N材料滅活大腸桿菌二次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment result of secondary rotation regression design on inactivated E.coli of modified P25-N material

Design expert程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出NP25改性材料對(duì)大腸桿菌抑菌率Y的回歸模型方程為:

Y=91.7-1.57A+1.3B+2.62C-0.48AB-1.73AC-0.43BC-7.31A2-0.51B2-1.61C2

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析表3中F值為20.61，說(shuō)明模型顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，說(shuō)明所選的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?。模型Pr＞F=0.000 3＜0.05，說(shuō)明所建立的二次回歸模型極顯著，表明回歸方程擬合程度較好，可以對(duì)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。條件(Pr＞F)＜0.05表明該條件是顯著條件，復(fù)相關(guān)指數(shù)為0.963 6，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型各因素對(duì)抑菌率的影響占96.36%。對(duì)各試驗(yàn)因子的的偏回歸系數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果表明:A2、C的偏回歸系數(shù)達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);A、B、AC、C2的偏回歸系數(shù)達(dá)到顯著水平(0.01＜P＜0.05)。

表3 模型方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results from model variance analysis and significance test

根據(jù)二次回歸的數(shù)學(xué)模型分析結(jié)果，最優(yōu)條件為摻雜量為8.72 g，煅燒溫度548.27℃，煅燒時(shí)間為1.87 h。考慮到實(shí)際可操作性，最終選取摻雜量為8.70 g，煅燒溫度548℃，煅燒時(shí)間為1.9 h。

3 結(jié)論

根據(jù)二次回歸模型分析結(jié)果可知，改性P25-N材料的最佳制備條件為:脲摻雜量8.70 g/g P25，煅燒溫度548℃，煅燒時(shí)間為1.9 h。可見(jiàn)光條件下，改性P25-N材料對(duì)大腸桿菌的抑菌率為90%，較未改性的P25材料抑菌率(79%)提高了11%，說(shuō)明通過(guò)N摻雜改性，可以P25提高其對(duì)光照的吸收能力，增強(qiáng)其可見(jiàn)光催化抑菌性，這為TiO2運(yùn)用于制備抑菌性水果包裝膜技術(shù)提供了可能。

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