木糖異構(gòu)酶釀酒酵母孢子“微膠囊”的構(gòu)建及酶學(xué)性質(zhì)分析*

李毅，李子杰，中西秀樹，高曉冬

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

釀酒酵母二倍體細(xì)胞在氮源缺乏且非發(fā)酵性碳源存在下，停止?fàn)I養(yǎng)生長(zhǎng)同時(shí)啟動(dòng)“產(chǎn)孢程序”，形成單倍體孢子［1-2］。與釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞壁相比，孢子壁包含有4種不同結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外依次為甘露糖層、β-葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。釀酒酵母孢子是一種休眠細(xì)胞，孢子壁所特有的二酪氨酸層和殼聚糖層結(jié)構(gòu)，尤其是二酪氨酸層，賦予孢子能夠抵御多種環(huán)境壓力的特性［2-5］?；駾IT1參與二酪氨酸在胞質(zhì)中的合成反應(yīng)即催化L-酪氨酸形成二酪氨酸，敲除DIT1基因?qū)?dǎo)致二酪氨酸層不能形成，因而dit1Δ孢子不含有二酪氨酸層［4］。osw2Δ孢子雖然具有二酪氨酸層，但是表現(xiàn)出乙醚敏感性，可能是由于OSW2基因的缺失導(dǎo)致二酪氨酸層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)大小發(fā)生改變［6］。

D-木糖異構(gòu)酶(XI，EC 5.3.1.5)是木糖代謝的關(guān)鍵酶，在工業(yè)上催化葡萄糖(木糖)到果糖(木酮糖)的轉(zhuǎn)化。為了賦予酵母代謝木糖的能力，多種來源的XI在酵母中進(jìn)行表達(dá)，但目前只有來源于Clostridium phytofermentans、Piromyces sp.strain E2、Thermus thermophilus、Orpinomyces、Clostridium cellulovorans的幾種XI具有生物活性［7-11］。但是，本文中將來源于 Clostridium phytofermentans和 Clostridium cellulovorans密碼子優(yōu)化后的xylA基因以及直接從Thermus thermophilus擴(kuò)增的xylA基因在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)，只有來源于Thermus thermophilus的基因檢測(cè)到對(duì)D-葡萄糖的催化活性。嗜熱菌Thermus thermophilus來源的XI首次在釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)，在85℃具有催化D-葡萄糖生成D-果糖的最高活性［11］。該酶的研究應(yīng)用主要集中兩個(gè)領(lǐng)域:一方面在分子基礎(chǔ)上的改造，降低其最佳催化溫度，利于釀酒酵母中異源表達(dá)發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精［12-13］;另一方面，作為一種嗜熱酶的模型，對(duì)其耐熱機(jī)理方面進(jìn)行研究［14］。釀酒酵母孢子“微膠囊”這一全新固定化酶技術(shù)是根據(jù)釀酒酵母在產(chǎn)孢前孢子膜形成過程中，改變了分泌蛋白的分泌途徑，使得高爾基體囊泡運(yùn)輸?shù)角版咦幽?，從而使蛋白定位在前孢子膜間隙中，在孢子壁組裝和前孢子膜外膜裂解過程中蛋白會(huì)被包埋在孢子壁中［2，15］。

本研究擬利用釀酒酵母孢子“微膠囊”這一全新固定化酶技術(shù)將來源于嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus HB8的D-木糖異構(gòu)酶以分泌形式表達(dá)固定到孢子壁上殼聚糖和二酪氨酸之間的周質(zhì)間隙，并以游離表達(dá)的XI作為對(duì)照，研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

釀酒酵母AN120野生型菌株，osw2Δ缺陷型菌株，dit1Δ缺陷型菌株以及質(zhì)粒相關(guān)信息見表1。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:酵母浸出粉10 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂粉20 g(固體)，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

YPD培養(yǎng)基:酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，加水至900 mL，121℃高壓滅菌20 min，使用前加入100 mL單獨(dú)滅菌的200 g/L葡萄糖。

SD-Trp培養(yǎng)基:無氨基酵母氮源(YNB)6.7 g，瓊脂粉20 g(固體培養(yǎng)基)，加水至900 mL，121℃高壓滅菌20 min，使用前分別加入100 mL單獨(dú)滅菌的200 g/L的葡萄糖和2 g缺少色氨酸(Trp)的氨基酸混合物。

YPA培養(yǎng)基:酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，醋酸鉀20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基:醋酸鉀20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

為了使帶有SPR1基因的分泌信號(hào)肽序列(ss)的木糖異構(gòu)酶基因xylA在TEF2基因強(qiáng)啟動(dòng)子TEF作用下以分泌形式表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體pRS424-TEFpr-ssxylA如下:以pRS424-TEFpr-ss-GFP為模板，HXO-153和xylA-R1為引物，PCR擴(kuò)增得到信號(hào)肽序列ss片段。以純化后的ss和xylA-R2為引物，T.thermophilus HB8的基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到ss-xylA片段。用SpeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶分別對(duì)ss-xylA片段和載體pRS424-TEFpr進(jìn)行雙酶切，16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB氨芐抗性平板，得到陽(yáng)性單克隆。為了構(gòu)建帶有3×HA標(biāo)簽的重組質(zhì)粒 pRS424-TEFpr-ss-xylA-3HA，先以 HA-F和HA-R為引物，pFA6a-3HA-His3MX6為模板，PCR擴(kuò)增得到3×HA片段，然后再以3×HA片段和HXO153為引物，PRS424-TEFpro-ss-xylA為模板，PCR擴(kuò)增得到ss-xylA-3HA片段。將得到的ss-xylA-3HA片段和載體pRS424-TEFpr分別用SpeI和EcoRI雙酶切，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB氨芐抗性平板，得到陽(yáng)性單克隆。為構(gòu)建重組質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-GFP-xylA，以xylA-F2和xylA-R2為引物PCR擴(kuò)增得到xylA片段，用PstI和EcoRI對(duì)xylA片段雙酶切后連接到pRS424-TEFpr-ss-GFP上。為構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xylA得到游離表達(dá)的XI純酶，以xylA-F1和xylA-R2為引物，T.thermophilus HB8的基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到xylA片段，經(jīng)NdeI和EcoRI雙酶切后連接到表達(dá)載體pET-28a上。

表1 本研究中所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中的引物Table 2 Primers used in this study

1.4 木糖異構(gòu)酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒pET28a-xylA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取正確轉(zhuǎn)化子到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將2 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到卡那霉素終濃度為50 μg/mL的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，待OD600約為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，于16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h。將細(xì)胞收集之后用10 mL平衡緩沖液(pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑)重懸，置于冰上超聲破碎，12 000 g離心30 min收集上清液，利用鎳親和層析柱純化上清中的XI。首先用平衡緩沖液平衡柱子，然后上樣使上清液以約1 mL/min的流速流過鎳柱。上樣完畢后先用平衡緩沖液洗掉以較小吸附力結(jié)合在柱子上的雜蛋白，然后用洗脫緩沖液(pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑)洗脫、收集目的蛋白，并用超濾管進(jìn)行脫鹽和濃縮，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，蛋白濃度用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)。

1.5 木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母孢子上的表達(dá)、固定及孢子純化

將重組質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-xylA分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母AN120野生型菌株、osw2Δ和dit1Δ缺陷型菌株，將酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到5 mL SD-Trp液體培養(yǎng)基，30℃過夜培養(yǎng)后將1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50 mL YPA培養(yǎng)基，30℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h，8 000 g離心1 min收集菌體，用無菌水洗滌2次后將菌體重懸在50 mL 2%的醋酸鉀培養(yǎng)基中，30℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h產(chǎn)孢。為了確保單個(gè)孢子能夠從子囊殼中釋放出來，將上述培養(yǎng)好的子囊孢子進(jìn)行酶處理和超聲破碎。具體過程如下:8 000 g離心1 min收集子囊孢子，然后用1×PBS緩沖液洗滌孢子并重懸在相同緩沖液中，充分混勻后加入lyticase(625 U/g濕細(xì)胞)，30℃處理30 min后8 000 g離心1 min收集處理過的細(xì)胞，棄掉上層清液，細(xì)胞沉淀用1×PBS緩沖液洗滌2次，重懸于相同緩沖液中，充分混勻，超聲破碎獲得單個(gè)孢子。將破碎后的孢子懸浮液用Percoll密度梯度離心的方法進(jìn)行純化，各梯度的配比如下:(1)80%Percoll，10%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L 蔗糖;(2)70%Percoll，20%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L 蔗糖;(3)60%Percoll，30%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L 蔗糖;(4)50%Percoll，40%0.5%Triton-X，10%2.5 mol/L蔗糖。將不同濃度梯度的Percoll溶液按照從高濃度到低濃度依次加入到離心管中，最后加入孢子懸浮液，15 000 g離心30 min，孢子和碎片分層，孢子將會(huì)位于離心管的底部，將上層液體和細(xì)胞碎片除去得到純化的孢子［17］。將純化的孢子用無菌水洗滌2遍后，進(jìn)行真空冷凍干燥得到孢子粉末。

1.6 熒光分析木糖異構(gòu)酶在不同孢子壁上的定位

為了進(jìn)一步驗(yàn)證XI是否表達(dá)在孢子壁上，將XI與綠色熒光蛋白GFP融合表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察XI在孢子壁上的定位。將重組質(zhì)粒pRS424-TEF-pr-ss-GFP-xylA分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母AN120野生型菌株，osw2Δ和dit1Δ缺陷型菌株，產(chǎn)孢過程同1.5，在尼康熒光倒置顯微鏡下，使用100×油鏡觀察，圖像利用NIS-Element AR軟件分析。

1.7 蛋白免疫印跡分析木糖異構(gòu)酶在不同孢子壁上的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pRS424-TEFpr-ss-xylA-3HA轉(zhuǎn)化釀酒酵母AN120野生型菌株，osw2Δ和dit1Δ缺陷型菌株，孢子的制備過程同1.5。將孢子重懸在8 mol/L尿素中，冰上超聲破碎1 h，使孢子上的蛋白全部溶解在尿素中，12 000 g離心10 min，取上清用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度。以YPA培養(yǎng)基培養(yǎng)后的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照，細(xì)胞破碎處理過程同孢子。最后取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，按照濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙由下到上的順序疊放于電轉(zhuǎn)儀(1.0 A，25 V，30 min)，電轉(zhuǎn)完成后用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜3 h并用TBST緩沖液(150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、體積分?jǐn)?shù)0.05%的吐溫)洗膜3次，然后用含有一抗(Rabbit anti-HA，1∶4 000稀釋)的牛奶室溫下孵育3 h。用TBST緩沖液洗膜3次后，用含有二抗(Goat anti-rabbit IgG HRP，1∶4 000稀釋)的牛奶室溫下孵育3 h。TBST清洗3次后，用ECL顯色試劑盒對(duì)其進(jìn)行顯色。

1.8 木糖異構(gòu)酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

XI的酶活測(cè)定在1.5 mL的體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系為100 mmol Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)、2 g/L D-葡萄糖、10 mmol/L MnCl2。向反應(yīng)體系中加入10 mg孢子(或3 μg游離酶)起始反應(yīng)，在85℃下反應(yīng)5 h后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。XI的酶活用高效液相色譜(HPLC)(HITACHI chromaster)進(jìn)行分析，檢測(cè)條件為:Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫60℃，5450示差檢測(cè)器。為了測(cè)定pH對(duì)XI酶活的影響，使用兩種緩沖液在85℃、不同pH條件下測(cè)定酶活。2種緩沖液分別為醋酸緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0 和 6.0)、Tris-HCl緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0，8.0和9.0)。為了測(cè)定溫度對(duì)XI酶活的影響，反應(yīng)體系以100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)作為緩沖液在不同溫度下(60～95℃)測(cè)定酶活。酶活的相對(duì)活性定義為最大酶活的百分比。為了測(cè)定孢子微膠囊固定XI的重復(fù)利用性，分別稱取10 mg凍干的3種孢子(野生型、osw2Δ和dit1Δ)，按上述測(cè)定酶法的方法測(cè)定轉(zhuǎn)化率，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后離心收集孢子，用超純水洗滌2次后進(jìn)行下一次轉(zhuǎn)化率測(cè)定，共測(cè)定5次。

2 結(jié)果與討論

2.1 木糖異構(gòu)酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)和純化

為了比較XI游離酶和孢子“微膠囊”XI固定化酶的酶學(xué)特性，首先在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)并純化了游離的XI。為了純化方便，在XI的N端設(shè)計(jì)了6×His的標(biāo)簽。從SDS-PAGE上來看，純化得到的木糖異構(gòu)酶分子質(zhì)量在40 kDa左右(圖1)，與預(yù)測(cè)的大小43.9 kDa相近，并且純度達(dá)到90%以上。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)木糖異構(gòu)酶的表達(dá)與純化Fig.1 SDS-PAGE analysis of XI expression and purification

2.2 熒光分析木糖異構(gòu)酶在不同孢子壁上的定位

為了更加直觀地觀察XI在孢子壁上的表達(dá)和定位，將XI與GFP進(jìn)行融合表達(dá)，通過GFP的熒光定位來確定XI的位置。從圖2中可以看到，對(duì)于野生型孢子和osw2Δ孢子來說，能夠清晰地看到GFP綠色熒光信號(hào)可以完好地包裹在未破子囊壁的孢子壁上，說明XI成功地表達(dá)在孢子壁上。相對(duì)于野生型孢子和osw2Δ孢子，dit1Δ孢子由于二酪氨酸層的缺失導(dǎo)致GFP信號(hào)強(qiáng)度稍弱，但仍可以觀察到融合蛋白表達(dá)定位到孢子壁上。

圖2 GFP標(biāo)記的XI在孢子上的定位Fig.2 Localization of GFP-XI fusion protein in yeast spores

2.3 蛋白免疫印跡分析木糖異構(gòu)酶在不同孢子壁上的表達(dá)水平

為了研究XI在不同類型孢子(營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照)的表達(dá)水平差異，將帶有3×HA標(biāo)簽的XI在相應(yīng)孢子中表達(dá)。從圖3中可知，相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞，孢子可以明顯包埋固定更多量的酶。野生型孢子和osw2Δ孢子表現(xiàn)出相對(duì)于dit1Δ更高的酶固定量，這與在dit1Δ孢子中表達(dá)的GFP-XI融合蛋白熒光信號(hào)較弱相一致，說明二酪氨酸層的存在可以在一定程度上能夠阻止酶的泄漏表達(dá)。

圖3 不同類型細(xì)胞的蛋白免疫印跡Fig.3 Western Blot of different cells

2.4 孢子“微膠囊”木糖異構(gòu)酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

盡管從GFP的熒光定位和western blot 結(jié)果可以確定XI成功地固定在孢子細(xì)胞壁上，但是由于細(xì)菌來源的蛋白表達(dá)、修飾不同于釀酒酵母，因此需要直接測(cè)定酶活來確定XI在孢子上是否具有催化活性。從圖4 HPLC檢測(cè)結(jié)果可以清楚地看到，底物D-葡萄糖在野生型孢子固定化酶的催化作用下可以轉(zhuǎn)化為D-果糖。

圖4 HPLC檢測(cè)固定在孢子上的XI的催化反應(yīng)Fig.4 HPLC analysis of the reaction of XI immobilized on spores

由于3種孢子孢子壁結(jié)構(gòu)的不同以及高溫反應(yīng)條件下有降低固定效率的可能，因此以重復(fù)利用性為標(biāo)準(zhǔn)來確定固定化酶的穩(wěn)定性。雖然dit1Δ孢子上的酶量低于野生型和 osw2Δ缺陷型(圖3)，但是dit1Δ孢子在第1次使用時(shí)表現(xiàn)出最高活性(圖5)。然而，dit1Δ孢子在第2次及多次使用后酶活下降迅速，可能是高溫破壞了酶與孢子的結(jié)合或者使結(jié)合不牢固的酶從孢子上脫離下來。相比較，雖然野生型和osw2Δ孢子由于二酪氨酸層的存在有效地阻止了酶的釋放，但是該層的存在在一定程度上影響了底物和酶的接觸。

圖5 XI在不同孢子上固定后的重復(fù)利用能力Fig.5 The reusabilities of XI immobilized on different spores

為了進(jìn)一步了解XI固定在野生型和osw2Δ孢子上的酶學(xué)特性，分別檢測(cè)了pH和溫度對(duì)酶活的影響。首先，在不同pH條件下反應(yīng)時(shí)，由圖6可以看到，孢子固定化酶和游離酶的最適pH值均為pH 7.0，對(duì)于野生型和osw2Δ孢子雖然沒有較大的pH耐受性差別，但孢子固定化酶相對(duì)于游離酶表現(xiàn)出范圍較廣的pH耐受性。同時(shí)，在不同溫度條件下反應(yīng)時(shí)，從圖7可以看到，孢子固定化酶和游離酶的最適溫度為85℃。值得注意的是，野生型和osw2Δ孢子固定化酶在95℃高溫下的相對(duì)酶活都能達(dá)到最高酶活的60%。綜合考慮，孢子壁中二酪氨酸層的存在，一方面能有效地阻止酶的釋放，另一方面又可以提高酶對(duì)高溫的耐受性。另外，根據(jù)osw2Δ孢子表現(xiàn)出來的酶學(xué)性質(zhì)，改變二酪氨酸層的疏松程度還可以提高酶和底物的結(jié)合能力。

圖6 pH對(duì)XI酶活的影響Fig.6 The effect of pH on the activity of XI

圖7 溫度對(duì)XI酶活的影響Fig.7 The effect of temperture on the activity of XI

3 結(jié)語(yǔ)

孢子“微膠囊”是一種新的酶固定化技術(shù)，通過分子生物學(xué)的方法使酶包埋在孢子殼聚糖層與二酪氨酸層之間，避免了蛋白純化和體外固定化等操作，并具有較好的重復(fù)使用性。因此，在醫(yī)藥、保健及食品等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本研究中，木糖異構(gòu)酶作為一種嗜熱酶，由于其較高的反應(yīng)溫度，有效地避免了孢子在底物D-葡萄糖條件下萌發(fā)的可能，同時(shí)作為稀有糖D-阿洛酮糖合成的第一步，在接下來的工作中可以與第二步D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶結(jié)合，實(shí)現(xiàn)從相對(duì)低廉的底物D-葡萄糖向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化。另外，發(fā)掘與孢子萌發(fā)相關(guān)的基因，避免孢子在應(yīng)用過程中的萌發(fā)，以及深入研究與二酪氨酸層結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因，改變二酪氨酸層的疏松程度，在此基礎(chǔ)上探索二酪氨酸層對(duì)酶的保護(hù)作用以及對(duì)底物分子的通透性，對(duì)于孢子“微膠囊”固定化酶系統(tǒng)的開發(fā)與利用具有重要意義。

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