花生粕多糖提取方法的比較和提取條件的優(yōu)化*

高思思，高航，徐虹

(北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京，100048)

花生，原名落花生，是亞洲、非洲等大部分地區(qū)的重要作物之一［1］?；ㄉ墒敲摎せㄉ?jīng)榨油后的副產(chǎn)物?；ㄉ沙实稚蛏詈稚?，有淡淡的花生香味，形狀為小塊或粉狀?；ㄉ炂筛缓喾N功效成分，如糖類、黃酮類、氨基酸、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、三萜或甾體類化合物和一些人體必需的微量元素等［2］，其中糖類物質(zhì)是花生粕的第二大功效成分，其含量在30%左右?，F(xiàn)代研究表明，多糖具有抗氧化、保護(hù)肝臟、降血糖等生物活性［3-6］。長期以來，對于花生粕的研究主要集中花生餅粕蛋白、多肽的制備上，花生餅粕中的多糖等活性物質(zhì)沒有被進(jìn)一步的深度開發(fā)利用［7-8］。

目前關(guān)于多糖的提取方法已有很多，如酸堿提取法［9-10］、超聲輔助提取法［11］、酶提取法［12］等，但均存在不同的缺點，如酸堿提取法易破壞多糖結(jié)構(gòu)且易造成酸堿殘留，超聲輔助提取法由于超聲波的空化作用和機(jī)械剪切作用可能造成多糖結(jié)構(gòu)的破壞和降解，酶提取法耗時長且成本高。微波提取技術(shù)因其快速、高效、安全的特點，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的開發(fā)研究中。本研究采用傳統(tǒng)的熱水浸提法和微波輔助提取法提取花生粕多糖并比較了提取效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花生粕，由山東沂蒙山花生油股份有限公司提供。

濃H2SO4(分析純)，購自北京化工廠;苯酚(分析純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;葡萄糖(分析純)，購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。

752N紫外可見分光光度計，上海精科有限公司;HH-501超級恒溫水浴(數(shù)顯)，常州國華電器有限公司;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實驗設(shè)備有限公司;高速冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司;微波催化合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝路線

熱水浸提法［13-15］:脫脂花生粕2 g→熱水浸提→10 000 r/min離心15 min→取上清液→苯酚-硫酸法測定總糖含量

微波輔助提取法［16-18］:脫脂花生粕2 g→加入一定量的蒸餾水→微波處理→10 000 r/min離心15 min→取上清液→苯酚-硫酸法測定總糖含量

1.2.2 多糖含量與提取率的計算

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取在105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品20 mg于500 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。準(zhǔn)確吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 及 1.8 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加蒸餾水補(bǔ)足到2.0 mL，然后再分別加入5%的苯酚1 mL，98%濃H2SO45 mL，靜止10 min，搖勻，在室溫下放置20 min。以0號管作為空白對照，在490 nm處分別測定吸光值，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=0.0148x+0.010 1，R2=0.998 3，說明葡萄糖在8～36 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2 樣品多糖含量的測定

精密吸取1 mL樣品溶液，采用苯酚-硫酸法，在490 nm處測定吸光值，從而利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中多糖的含量。多糖提取率用下式計算:

1.2.2.3 單因素試驗

熱水浸提法:分別以料液比、提取時間、提取溫度為單因素進(jìn)行試驗，考察各單因素對花生粕多糖提取率的影響。

微波輔助提取法:分別以料液比、微波時間、微波功率為單因素進(jìn)行試驗，考察各單因素對花生粕多糖提取率的影響。

1.2.2.4 微波輔助提取法正交試驗設(shè)計

選取微波時間(A，min)、微波功率(B，W)、料液比(C，g∶mL)，做4 因素3 水平(L34)的正交試驗優(yōu)化花生粕多糖的提取工藝，實驗因素和水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels oforthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水浸提法單因素實驗

2.1.1 提取時間對多糖提取率的影響

稱取脫脂花生粕2 g，粉碎過100目篩，固定料液質(zhì)量比為1∶10(g∶mL)，溫度90℃下分別提取60、90、120、150、180 min，不同提取時間的花生粕多糖提取率變化如圖1所示。

圖1 提取時間對多糖提取率的影響Fig.1 Influence ofextraction time on the yield of polysaccharide extraction

由圖1可知，提取時間對花生粕多糖提取率有較大影響。隨著提取時間的延長，花生粕多糖的提取率逐漸增加，在120 min時花生粕多糖的提取率達(dá)到最大，超過120 min后，多糖提取率隨時間的延長逐漸下降。故選擇120 min作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的浸提時間。

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響

稱取脫脂花生粕2 g，粉碎過100目篩，固定料液質(zhì)量比為1∶10(g∶mL)，在溫度為 60、70、80、90、100℃條件下浸提120 min，不同提取溫度的花生粕多糖提取率變化如圖2所示。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on the yield of polysaccharide extraction

由圖2可知，在所選的5個溫度下，隨著溫度的升高，花生粕多糖的提取率隨之提高，其中多糖的提取率從90℃到100℃有非常明顯的提高，到達(dá)100℃時提取率達(dá)到最大。故選擇100℃作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的浸提溫度，但實際生產(chǎn)中，還要結(jié)合生產(chǎn)條件、設(shè)備等條件進(jìn)行選擇。

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響

稱取脫脂花生粕2 g，粉碎過100目篩，料液質(zhì)量比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)，在溫度為100℃條件下浸提120 min，不同料液比的花生粕多糖提取率變化如圖3所示。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Influence of solid/liquid ratio on the yield of polysaccharide extraction

由圖3可知，隨著料液比的增加，花生粕多糖的提取率先增大后減少，在1∶40(g∶mL)處達(dá)到最大值，隨后增大料液比，多糖的提取率開始緩慢下降，故選擇1∶40作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的浸提料液比。

2.2 微波輔助提取法單因素實驗

2.2.1 提取時間對多糖提取率的影響

稱取脫脂花生粕2 g，粉碎過100目篩，固定料液質(zhì)量比為1∶10(g∶mL)，功率為400 W下分別提取1、2、3、4、5 min，不同提取時間的花生粕多糖提取率變化如圖4所示。

圖4 微波輔助提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Influence of extraction time on the yield of polysaccharide extraction assisted by microwave

由圖4可知，在提取時間為2 min以前，隨著提取時間的延長，多糖提取率逐漸升高。但輻射時間超過2 min時，花生粕多糖的提取率反而有所下降，可能是因為微波在短時間內(nèi)迅速升溫，微波時間越長溫度越高，過高的溫度使部分多糖結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致提取率下降。故選擇2 min作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的最佳提取時間。

2.2.2 微波功率對多糖提取率的影響

稱取脫脂花生粕2 g，粉碎過100目篩，固定料液質(zhì)量比為1∶10(g∶mL)，在功率為200、300、400、500、600 W條件下浸提2 min，不同微波功率的花生粕多糖提取率變化如圖5所示。

圖5 微波功率對多糖提取率的影響Fig.5 Influence of microwave power on the yield of polysaccharide extraction

由圖5可知，隨微波功率提高，花生粕多糖提取率隨之提高，當(dāng)提取功率達(dá)到300～400 W時達(dá)到最大，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)提取功率分別為300 W和400 W時，所得提取率之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。但之后多糖提取率隨微波功率的提高而逐漸下降，可能是因為功率過高導(dǎo)致多糖氧化分解。故選擇微波功率為300 W作為進(jìn)一步優(yōu)化的提取條件的最佳功率。

2.2.3 料液比對多糖提取率的影響

稱取脫脂花生粕2 g，粉碎過100目篩，料液質(zhì)量比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)，在功率為400 W條件下輻射2 min，不同料液比的花生粕多糖提取率變化如圖6所示。

圖6 微波輔助料液比對多糖提取率的影響Fig.6 Influence of solid/liquid ratio on the yield of polysaccharide extraction assisted by microwave

由圖6可知，隨著料液比提高，花生粕多糖提取率隨之提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20(g∶mL)時達(dá)到最大，之后再提高料液比，多糖提取率提高不顯著，可能是因為多糖的溶出率已達(dá)到平衡，再增加提取液的量，溶出率也不會增加。故選擇1∶20作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的最佳料液比。

2.3 微波輔助提取法正交試驗結(jié)果與分析

為了確定在提取過程中各因素的影響大小，本研究對微波輔助提取法提取花生粕多糖的3個單因素即提取時間(A)、微波功率(B)、料液比(C)進(jìn)行正交試驗，并以多糖提取率作為提取工藝的判斷依據(jù)，正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

由表2的極差分析結(jié)果顯示，3個因素對花生粕多糖的提取率的影響依次為:微波功率(B)＞提取時間(A)＞料液比(C)，正交優(yōu)化的條件為A2B1C3，即提取時間為2 min，微波功率為300 W，料液比為1∶25(g∶mL)。

2.4 驗證性實驗

由于正交實驗所確定的最佳條件并未包含在正交表的9個實驗中，為了進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果，按微波法提取花生粕多糖的最佳工藝條件A2B1C3，即提取時間為2 min，微波功率為300 W，料液比為 1∶25(g∶mL)的條件下分別進(jìn)行重復(fù)性試驗3次，進(jìn)行驗證，結(jié)果見表3。

表3 驗證實驗結(jié)果Table 3 Verification testing results

由表3可知，在此工藝條件下，多糖平均提取率為(9.93±0.03)%，優(yōu)于正交實驗中任何一組。驗證實驗結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為A2B1C3。

2.5 兩種提取方法比較

同法采用常規(guī)熱水浸提法得出花生粕多糖的最佳提取條件為料液比為1∶40(g∶mL)，提取時間為120 min，提取溫度為100℃，花生粕多糖提取提取率平均值為10.35%;微波輔助提取法最佳提取條件為料液比為1∶25(g∶mL)，提取時間為2 min，微波功率為300 W，花生粕多糖提取提取率平均值為9.93%。兩種提取方法比較見表4。

由表4可知，熱水浸提法花生粕多糖的提取率為10.35% ，微波輔助提取多糖的提取率為9.93%。與傳統(tǒng)高溫?zé)崴岬姆椒ㄏ啾容^，微波輔助法的花生粕多糖提取率雖比傳統(tǒng)高溫?zé)崴岱ń档土?.42%，但采用微波輔助強(qiáng)化提取花生粕多糖的方法明顯地縮短了提取時間，減小了料液比。所以，微波輔助方法具有迅速、節(jié)能的特點，是強(qiáng)化輔助提取多糖的較好方法。

3 結(jié)論

本試驗采用熱水浸提法和微波輔助提取法提取花生粕多糖，并對花生粕多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。熱水浸提法的最佳工藝條件為:料液比為1∶40(g∶mL)、提取時間為120 min、提取溫度為100℃，多糖的提取率為10.35%;而微波輔助提取法適宜的提取條件為料液比為1∶25(g∶mL)、微波時間為2 min、微波功率為300 W，多糖提取率的平均值為9.93%。

本研究所用的微波輔助提取法提取花生粕多糖的提取率為9.93%，較文獻(xiàn)報道的超聲波法［19］、酶法［20］的提取率有了一定的提高，且超聲波法因設(shè)備價格高等原因，使其在工業(yè)化生產(chǎn)上具有一定的局限性，酶法的效果受溫度、pH、底物濃度、抑制劑等因素的限制，且耗時長、成本高，而微波法輔助提取花生粕多糖具有短時高效的特點，故微波輔助提取法是強(qiáng)化輔助提取多糖的較好方法，可為進(jìn)一步研究多糖結(jié)構(gòu)和生理功能奠定基礎(chǔ)。

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