溫度對(duì)“半胱氨酸-木糖”模型體系初始美拉德中間體及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響*

曹長(zhǎng)春，石景艷，謝建春，孫寶國(guó)

(食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京，100048)

美拉德反應(yīng)又稱“羰-氨”反應(yīng)，是食品熱加工風(fēng)味形成的重要途徑之一。半胱氨酸是肉香味形成的重要前體，有關(guān)半胱氨酸與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生肉香味的研究已有較多報(bào)道［1-6］。Hofmann 等［5］分析鑒定了半胱氨酸分別與葡萄糖和鼠李糖反應(yīng)產(chǎn)生的肉香味成分;Cerny等［6］將半胱氨酸與同位素標(biāo)記的核糖反應(yīng)，研究了肉香味成分的形成途徑。

與其他氨基酸不同，半胱氨酸因含有巰基官能團(tuán)，在Maillard初級(jí)反應(yīng)階段除形成半胱氨酸Amadori重排物外，還可形成2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體［7-8］。初級(jí)階段形成的該中間體往往占有很大比例，對(duì)美拉德反應(yīng)有抑制作用。有報(bào)道［9-10］半胱氨酸的存在可抑制大豆蛋白酶解液、蘋果汁和葡萄汁等的非酶褐變。但2-糖基噻唑烷-4-羧酸與半胱氨酸Amadori重排物存在可逆轉(zhuǎn)化，在受熱條件下，半胱氨酸Amadori發(fā)生降解反應(yīng)，從而導(dǎo)致可逆平衡被打破，使形成的2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體不斷轉(zhuǎn)化成半胱氨酸Amadori。半胱氨酸Amadori的受熱降解反應(yīng)，涉及了經(jīng)1，2-烯醇化或2，3-烯醇化及脫水、脫氨等過(guò)程形成糠醛、羥甲基糠醛、呋喃酮、二羰基化合物等降解產(chǎn)物。這些與還原糖相關(guān)的降解產(chǎn)物再與半胱氨酸降解產(chǎn)生的硫化氫或氨作用，可形成2-甲基-3-呋喃硫醇、2-糠硫醇、2-甲基噻吩、3-甲基吡嗪等含硫化合物或雜環(huán)化合物，從而使熱反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)似肉的香味［6，11-13］。

溫度對(duì)美拉德反應(yīng)有重要影響，不同溫度下美拉德反應(yīng)初始中間體Amadori的形成速率和積累量不同，產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味和顏色不同［14-16］。在原料組成和pH值等其他條件固定時(shí)，溫度越高，Amadori的降解速率越快，促使2-糖基噻唑烷-4-羧酸中間體轉(zhuǎn)化成半胱氨酸Amadori的速率也越快，從而半胱氨酸消耗得越多，利用率越高。本文以“半胱氨酸-木糖”為模型，研究了不同溫度下，體系中形成的初始美拉德中間體2-木糖基噻唑烷-4-羧酸(2-xylulosylthiazolidine-4-carboxylic acid，XTCA)、半胱氨酸 Amadori的含量及半胱氨酸的含量隨反應(yīng)時(shí)間的變化及溫度對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

15 mL耐壓密封管，北京欣維爾玻璃儀器有限公司;手動(dòng)固相微萃取手柄、75 μm Carboxen/PDMS萃取纖維、15 mL樣品瓶及聚丙烯瓶蓋、聚四氟乙烯-硅樹(shù)脂隔膜，美國(guó)Supelco公司。

PHSJ-5型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;OSB-200油浴型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Eyela公司;DF-101型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南鞏義市予華儀器有限公司;Agilent1100高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司;SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，法國(guó)SEDERE公司;XWK-Ⅲ無(wú)油空氣泵，天津市華生分析儀器廠;7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 試劑與材料

L-半胱氨酸、D-(+)-木糖，生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司;二水合磷酸二氫鈉、甲酸銨、甲酸，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司;NaOH，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;1，2-鄰二氯苯，分析純，北京化學(xué)試劑公司;C7～C30正構(gòu)烷烴、色譜純乙腈，迪馬科技有限公司;AG 50W-X4 H-型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(200～400目)，美國(guó) Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型反應(yīng)

在15 mL耐壓密封管中，加入 L-半胱氨酸1 mmol(0.121 g)、D-(+)-木糖 1 mmol(0.150 g)，NaH2PO4-NaOH緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=5.5)5 mL，油浴加熱。

(1)分別在溫度 120、130、140、150、160 ℃下，反應(yīng)90 min，并每隔10 min取樣，按1.3.2進(jìn)行固相萃取/高效液相色譜分析，研究溫度對(duì)美拉德反應(yīng)初始中間體形成及半胱氨酸利用率的影響。平行做3份樣品。

(2)分別在溫度 120、130、140、150、160 ℃下，反應(yīng)60 min，按1.3.3固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析，比較不同溫度下產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。平行做3份樣品。

1.3.2 固相萃取/高效液相色譜分析

固相萃取柱，填料為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，800 mg/1.5 mL，實(shí)驗(yàn)室手動(dòng)填裝。先用6 mL 1 mol/L HCl活化，再將1.3.1(1)中所取反應(yīng)液上樣1 mL，10 mL水洗，6～8 mL 0.5 mol/L氨水溶液洗脫，收集氨水洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1.5 mL，定容至2 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，待高效液相色譜分析。

高效液相色譜分析條件:Waters Xbridge Amide(4.6 mm × 150 mm，3.5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:0.02 mol/L甲酸銨與乙腈(體積比=4∶6)的混合溶液，用0.02%甲酸調(diào)至pH 6;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣1 μL，共運(yùn)行11 min。柱溫25℃。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，蒸發(fā)管溫度40℃，霧化氣(空氣)流速3.5 bar，增益值5。

1.3.3 固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析

萃取纖維按照使用說(shuō)明事先老化。將1.3.1(2)制備的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入1.5 μL 內(nèi)標(biāo)鄰二氯苯(200 μg/mL，溶劑甲醇)、約1 g NaCl，混合均勻，水浴加熱至60℃平衡10 min后，60℃頂空吸附30 min。

氣相色譜-質(zhì)譜分析:(1)色譜柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，溫度40 ℃，以4 ℃/min升至230℃;(2)色譜柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，溫度40℃，以3℃/min升至180℃，再以20℃/min升至280℃，保持2 min。載氣為He，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣，萃取纖維脫附5 min。電子轟擊離子源(EI)，能量70 eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃。

在相同條件下進(jìn)樣C7～C30正構(gòu)烷烴，計(jì)算保留指數(shù)。

所檢測(cè)化合物含量計(jì)算見(jiàn)公式(1):

式中:m為鑒定化合物質(zhì)量，ng，A為化合物峰面積;ρ 為內(nèi)標(biāo) 1，2-二氯苯質(zhì)量濃度，200 μg/mL;A0為內(nèi)標(biāo)面積，V為加入的內(nèi)標(biāo) 1，2-二氯苯體積，1.5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取/高效液相色譜分析

圖1為溫度為140℃時(shí)模型反應(yīng)20 min取樣經(jīng)固相萃取處理后，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)分析所得譜圖。

圖1 140℃時(shí)“半胱氨酸-木糖”反應(yīng)20 min取樣的固相萃取/高效液相色譜分析譜圖Fig.1 The HPLC-ELSD chromatogram in the analysis of the reaction mixture of cysteine with xylose for 20 min at 140℃after pretreated by solid phase extraction

標(biāo)號(hào)1的峰為半胱氨酸的峰;標(biāo)號(hào)2的峰為XTCA的峰，標(biāo)號(hào)3的峰為半胱氨酸-Amadori的峰，3種物質(zhì)分離較好。ELSD是20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的一種通用性質(zhì)量型檢測(cè)器，能檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品，其響應(yīng)不依賴于被分析物質(zhì)的理化性質(zhì)，具有靈敏度高、受溫度等實(shí)驗(yàn)條件影響小和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)［17］，因而本文采用ELSD檢測(cè)定量研究和比較反應(yīng)體系中的XTCA、半胱氨酸-Amadori及半胱氨酸的含量受溫度的影響。

2.2 XTCA、半胱氨酸Amadori及半胱氨酸的含量隨時(shí)間變化

在不同溫度下進(jìn)行模型反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，按10 min間隔取樣，分析體系內(nèi)初始中間體 XTCA、半胱氨酸Amadori及半胱氨酸的含量，分別繪制XTCA、半胱氨酸Amadori的含量(峰面積)、半胱氨酸的含量(占初始面積的百分比)隨反應(yīng)時(shí)間變化曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度下XTCA(a)、半胱氨酸-Amadori(b)及半胱氨酸(c)的含量隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線Fig.2 The change curves of the contents of XTCA，cysteine-Amadori，and cysteine，respectively，with times under different reaction temperatures

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，弱酸性條件下美拉德反應(yīng)初始中間體XTCA非常易于形成，室溫下即檢測(cè)到可觀量的XTCA。由圖2可知，從120～160℃，反應(yīng)開(kāi)始10min時(shí)，體系內(nèi)已有大量XTCA，且XTCA含量遠(yuǎn)高于半胱氨酸Amadori含量。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，XTCA仍在生成，但因不斷轉(zhuǎn)化成半胱氨酸Amadori，因此在各溫度下其含量均呈下降趨勢(shì)，且溫度越高下降得越快。而半胱氨酸Amadori的積累量在各溫度下呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)不同:120、130、140℃呈現(xiàn)鐘形曲線，分別在50、20、20 min達(dá)到極值，然后慢慢下降，其中130℃反應(yīng)90 min時(shí)和140℃反應(yīng)60 min時(shí)已很少，但120℃反應(yīng)90 min時(shí)仍有較多剩余;150、160℃半胱氨酸Amadori的含量則一直呈陡峭的下降趨勢(shì)，分別在60，30 min時(shí)已很少。

相比之下，溫度越低半胱氨酸Amadori的降解速率越慢，體系內(nèi)XTCA及半胱氨酸Amadori的積累量就越多，表現(xiàn)為相同時(shí)間下120℃時(shí)檢測(cè)到的XTCA及半胱氨酸Amadori的含量在各溫度中均最高，且含量的下降趨勢(shì)最平緩。由于半胱氨酸Amadori的含量是XTCA的轉(zhuǎn)化(使其增加)及半胱氨酸Amadori降解(使其減少)兩方面綜合作用后的結(jié)果，因而在較低溫度時(shí)(120，130，140℃)半胱氨酸 Amadori出現(xiàn)極值，在較高溫度時(shí)(150，160℃)因降解速率大于生成速率一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

此外，由圖2半胱氨酸的含量下降趨勢(shì)曲線還可以看出，溫度越高，反應(yīng)越快，半胱氨酸消耗越快。在160℃下反應(yīng)40 min半胱氨酸幾乎消耗完，140℃下反應(yīng)60 min剩余20.3%，而在溫度120℃反應(yīng)90 min時(shí)半胱氨酸仍有較多剩余，為46.2%。

2.3 不同溫度下所得反應(yīng)產(chǎn)物的顏色、氣味及揮發(fā)性成分比較

相同時(shí)間下，反應(yīng)溫度不同，體系內(nèi)XTCA、Amadori的積累量及半胱氨酸的消耗量不同，產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類及含量不同。在 120、130、140、150、160℃下分別反應(yīng)60 min，所得反應(yīng)產(chǎn)物的顏色、氣味及檢測(cè)到的揮發(fā)性化合物的峰個(gè)數(shù)和含量結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，溫度越高，反應(yīng)液的顏色越深，褐變程度越高。120℃時(shí)為蔥、蒜香，高于120℃則出現(xiàn)焦糊味，160℃時(shí)出現(xiàn)刺激性氣味。比較不同溫度下所得反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分峰個(gè)數(shù)和總量，溫度高(140，150，160℃)時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物峰個(gè)數(shù)多且總量高，140℃時(shí)均為最大。對(duì)肉香味貢獻(xiàn)較大的為含硫化合物，溫度較低時(shí)(120，130℃)產(chǎn)生的含硫揮發(fā)性成分的峰個(gè)數(shù)和含量較少，溫度高(140，150，160℃)時(shí)二者均顯著增多，160℃時(shí)峰個(gè)數(shù)最多，但140℃時(shí)含硫化合物的含量最多。這可能因?yàn)闇囟容^低時(shí)(120，130℃)反應(yīng)速率慢，半胱氨酸Amadori降解慢，產(chǎn)生的揮發(fā)性成分的峰個(gè)數(shù)和含量均較少;而溫度較高時(shí)(150，160℃)半胱氨酸Amadori降解快，反應(yīng)復(fù)雜，一些含硫化合物的縮合、聚合反應(yīng)較為強(qiáng)烈，例如2-甲基-3-呋喃硫醇轉(zhuǎn)化成其二聚體雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚，從而造成檢測(cè)到的峰個(gè)數(shù)增加，但有些化合物聚合后揮發(fā)度降低會(huì)使檢測(cè)到的總含量減少。綜合考慮半胱氨酸利用率、香味特征、及含硫風(fēng)味物質(zhì)的峰個(gè)數(shù)和含量等因素，認(rèn)為140℃反應(yīng)60 min為采用“半胱氨酸-木糖”模型反應(yīng)研究肉香風(fēng)味物質(zhì)形成的較適宜條件。

表1 不同溫度條件下所得反應(yīng)產(chǎn)物的顏色、氣味及檢測(cè)的揮發(fā)性化合物的量Table 1 The colors，smells and the amount of volatile compounds analyzed from the reaction products prepared in different reaction temperatures by solid phase micro-extraction(SPME)and GC-MS

2.4 140℃下反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

“半胱氨酸-還原糖”美拉德反應(yīng)是產(chǎn)生肉香味的重要反應(yīng)。對(duì)肉香味有貢獻(xiàn)的主要是含硫化合物及含O或N雜環(huán)化合物。為了確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中采用極性、弱極性雙柱定性，通過(guò)NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索及核對(duì)保留指數(shù)對(duì)檢測(cè)到的含硫化合物和雜環(huán)化合物進(jìn)行鑒定。

由表2可知，從140℃條件下的熱反應(yīng)產(chǎn)物中共鑒定出53種成分，包括含硫類(40種)，含氮雜環(huán)類(5種)，含氧雜環(huán)類(8種)。無(wú)論是弱極性柱還是極性柱，含量最高的均為含硫化合物，其次為含氧雜環(huán)，含氮雜環(huán)相對(duì)較少。含硫化合物包括硫醇及硫醚類(18種)，噻吩類(18種)，噻唑類(4種);含量最高的為硫醇及硫醚類，噻吩類其次，噻唑類含量最少。硫醇、噻吩、噻唑均為“半胱氨酸-還原糖”反應(yīng)常出現(xiàn)的揮發(fā)性香味成分，硫醇進(jìn)一步發(fā)生縮合或聚合反應(yīng)可形成硫醚。硫醇類一般具有大蒜味、烤香味、H2S樣味等;噻吩類具有洋蔥味、焦味、咖啡香味、橡皮味等;噻唑類具有烤肉味、堅(jiān)果味。

2-甲基-3-呋喃硫醇，2-糠硫醇、2-噻吩硫醇、2-甲基噻吩并［2，3-b］噻吩、2，5-噻吩二甲醛、二糠基二硫醚、雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、糠醛等為檢測(cè)到的主要成分。2-甲基-3-呋喃硫醇?xì)馕堕撝禐?.002 5 ng/L，具有蔥香、蒜香和硫化物氣味;2-糠硫醇?xì)馕堕撝禐?.005 ng/L，具有烤香、咖啡香、肉香，它們都是構(gòu)成煮牛肉、豬肉的主要香味成分［18］;雙(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚和二糠基二硫醚分別為2-甲基-3-呋喃硫醇、2-糠硫醇的二聚體，也是煮肉湯味的重要化合物［19］。

表2 140℃反應(yīng)60 min產(chǎn)物中檢測(cè)出的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 The main volatile flavor compounds identified by SPME/GC-MS from the reaction products prepared at 140℃for 60 min

續(xù)表2

續(xù)表2

3 結(jié)論

(1)在 pH 5.5 及溫度120，130，140，150，160 ℃的條件下，“半胱氨酸-木糖”反應(yīng)形成的美拉德初始中間體2-木糖基噻唑烷-4-羧酸與半胱氨酸Amadori的含量存在正相關(guān)，溫度越高，半胱氨酸Amadori隨反應(yīng)時(shí)間的降解越快，二者在體系內(nèi)的積累量越低，造成半胱氨酸的利用率越高，反應(yīng)產(chǎn)物的氣味越濃，但同時(shí)夾雜的焦糊氣味也越重。

(2)綜合考慮半胱氨酸的利用率、反應(yīng)產(chǎn)物的肉香特征、及產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物總量及含硫化合物的量，得出140℃反應(yīng)60 min為較適宜條件。采用雙柱定性、保留指數(shù)比對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索，從140℃反應(yīng)60 min的產(chǎn)物中鑒定出53種化合物，包括2-甲基-3-呋喃硫醇、2-糠硫醇等在內(nèi)的重要含硫肉香物質(zhì)40種，含氮雜環(huán)5種，含氧雜環(huán)8種。

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