磁性F3O4-苯丙氨酸解氨酶仿生固定化及其催化性能研究*

岳姝，劉容麟，馮玉曉，端沖，趙雅敏，李林波，崔建東

(河北科技大學(xué)，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊，050018)

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是酶法生產(chǎn)L-苯丙氨酸和治療苯丙酮尿癥的關(guān)鍵酶［1］，存在于各種植物和少數(shù)微生物中，具有廣泛的醫(yī)藥和工業(yè)應(yīng)用價值［2］。但在應(yīng)用過程中，該酶表現(xiàn)出不穩(wěn)定、易失活的問題。酶固定化技術(shù)能改善酶的穩(wěn)定性和催化性能［3-5］。

仿生硅化固定化酶是近年來國內(nèi)外固定化酶研究的熱點，該技術(shù)具有制備條件溫和、操作簡單、酶固定化效率和酶活保留率高等優(yōu)點。目前已經(jīng)被成功應(yīng)用在氨基酸氧化酶［3］、脂肪酶［4］、碳酸酐酶［6］等多種酶的固定化。但該方法也存在一些缺點，如形成的固定化酶顆粒小、難以回收重復(fù)利用。磁性納米顆粒具有強(qiáng)的磁響應(yīng)、納米級的尺寸、較大的比表面積，是一種理想的酶固定化材料。但傳統(tǒng)的磁性納米顆粒固定化酶一般需要對納米顆粒表面進(jìn)行功能基團(tuán)修飾，操作條件苛刻，而且制備出的固定化酶活性損失大，影響了固定化酶的催化效率［7］。

本研究以PAL酶蛋白作為自誘導(dǎo)劑，以正硅酸甲酯(TMOS)為硅前驅(qū)體，在誘導(dǎo)生成納米氧化硅的同時將PAL和磁性納米顆粒共包埋在氧化硅顆粒中，制備出磁性仿生氧化硅固定化酶，該固定化酶既保證了酶分子的原位包埋固定，避免了共價固定產(chǎn)生的酶構(gòu)象改變的缺點，同時又引入磁性納米顆粒，使固定化酶能利用磁場簡單的回收重復(fù)利用，是一種將磁性納米顆粒與仿生硅化有效結(jié)合的固定化酶方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘紅酵母(Rhodotorula gluinis)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC32913);正硅酸甲酯(TMOS)和異硫氰酸熒光素(FITC)，阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他試劑均為市售分析純。

S-4800-Ⅰ型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本HITACHI;JEM-2100透射電子顯微鏡，日本JEOL;IX51倒置熒光顯微鏡，美國OLYMPUS;752型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司;TGL-16C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;HC-3018型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;85-1B磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;FD-27真空冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PAL的提取

將粘紅酵母接種在發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.5 g/L，(NH4)2HPO41 g/L，L-苯丙氨酸 0.5 g/L，pH5.5)中，于 28 ℃，150 r/min下發(fā)酵培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)后的粘紅酵母利用玻璃珠破碎和凝膠過濾提取PAL酶［8］。PAL比酶活為0.86 U/mL。

1.2.2 磁性納米顆粒的制備

采用化學(xué)共沉淀法［7］制備磁性納米顆粒，1.25 g FeCl2·4H2O和3.40 g FeCl3·6H2O溶解到100 mL去離子水中，在60℃下，加入6 mL 25%NH3·6H2O劇烈攪拌30～40 min。使用磁鐵沉淀磁性顆粒，用去離子水洗滌3次后，超聲1 h后備用。

1.2.3 仿生硅化固定化苯丙氨酸解氨酶

取0.152 g TMOS與1 mmol/L HCl溶液混合，振蕩10 min，制得濃度為1 mol/L TMOS水解液。取5 mL PAL酶樣品(溶解在25 mmol/L磷酸鹽，pH 7.0)與1 mL質(zhì)量濃度為20 mg/mL磁性納米顆粒充分混勻后，加入2 mL濃度為0.8 mol/L TMOS水解液，混合5 min后，固定化酶用磁鐵回收，得到的沉淀物用去離子水洗滌3次，即得固定化PAL。

1.2.4 固定化PAL的形態(tài)觀察

固定化PAL樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金后利用電子掃描顯微鏡(電子發(fā)射電壓60～100 kV)和透射電鏡(電子發(fā)射電壓200 kV)檢測。利用50 mg異硫氰酸熒光素(FITC)溶于8 mL二甲基亞砜(DMSO)，加入100 mL溶有1 g酶的磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)，室溫下避光攪拌溶解2 h。加入無水乙醇(與溶液的量大約等量即可)沉淀標(biāo)記好的蛋白，離心除去多余的FITC。沉淀需要清洗3次。標(biāo)記好FITC的PAL酶用于固定化，用熒光倒置顯微鏡觀察固定化酶。

1.2.5 酶活測定方法

以紫外分光光度法測定PAL的酶活［9］。酶促反應(yīng)液包括一定量的酶樣品，2.5 mL 50 mmol/L L-苯丙氨酸和2 mL 25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，反應(yīng)在30 ℃振蕩保溫10 min，然后加入0.2 mL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。10 000×g離心5 min，取上清液在278 nm下測吸光值。固定化酶的酶活測定與游離酶相似，不同在于酶促反應(yīng)終止后用磁鐵回收沉淀。根據(jù)反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。酶活力單位定義:每分鐘催化L-苯丙氨酸生成1 μmol反式肉桂酸的酶量為1個酶活力單位。

1.2.6 酶活回收率

1.2.7 統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)進(jìn)行3次，利用SAS軟件(v8.0)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.8 實驗設(shè)計

1.2.8.1 固定化PAL制備條件優(yōu)化

利用單因素實驗考察了TMOS質(zhì)量濃度(2，4，6，8，10 mg/mL)、粗酶量(1，3，5，7，9 mL，0.86 U/mL)、磁性納米顆粒質(zhì)量濃度 (10，20，30，40，50 mg/mL)對固定化PAL的影響。

1.2.8.2 固定化PAL的穩(wěn)定性考察

對于溫度穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別置于60℃下處理15，30，45和60 min后，分別檢測酶活。對于pH穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別置于pH為2，5，8和11的緩沖液中處理60 min后，檢測酶活。對于變性劑穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別置于2%SDS，40%乙醇和6 mol/L尿素中處理30 min，檢測酶活。對于儲存穩(wěn)定性，將游離酶和固定化PAL分別保存在25 mmol/L磷酸鹽(pH 7.0)中，于25℃放置1，6。12和18 d，并在相對應(yīng)的儲存時間檢測酶活。

1.2.8.3 固定化PAL的重復(fù)使用性考察

重復(fù)使用穩(wěn)定性實驗:將一定量的固定化PAL在30℃條件下催化底物L(fēng)-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，反應(yīng)15 min后，磁場分離出固定化酶，用Tris-HCl(pH 8.8)緩沖液洗滌后，在固定化酶中加入新的底物進(jìn)行第2輪轉(zhuǎn)化，依此分批催化，每次催化反應(yīng)后分別檢測固定化酶剩余的酶活。直到檢測不到酶活為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化PAL制備條件優(yōu)化

2.1.1 反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=14.083X-0.562 1，R2=0.999 9，由此計算酶活。

2.1.2 TMOS水解液濃度對固定化酶的影響

圖1 TMOS水解液濃度對酶活回收率的影響Fig.1 Effects of TMOS concentration on activity recovery

從圖1可以得出，TMOS水解液濃度對固定化PAL酶活有較大的影響，固定化酶的酶活回收率隨著TMOS濃度的增加而增加，當(dāng)TMOS水解液濃度為0.8 mol/L時，酶活回收率最高，但當(dāng)TMOS水解液濃度超過0.8 mol/L，酶活回收率開始下降。這可能是由于反應(yīng)體系中TMOS濃度過大時，剩余的TMOS不能被PAL酶蛋白催化聚合形成氧化硅，導(dǎo)致對PAL的包埋率下降，使酶活回收率降低［4］。

2.1.3 酶蛋白數(shù)量對固定化酶的影響

由圖2可以看出，隨著酶蛋白數(shù)量增加，固定化酶的酶活也在增加，當(dāng)酶蛋白量達(dá)到5 mL(0.86 U/mL)時，酶活回收率達(dá)到最高，而隨著酶蛋白量的繼續(xù)增加，酶活回收率基本不再變化。這可能是由于TMOS硅前體的量一定，只能沉淀一定量的硅膠對酶進(jìn)行包埋，而過剩的酶不能被包埋在硅膠中，從而使酶活回收率保持不變。

2.1.4 磁性納米顆粒質(zhì)量濃度對固定化酶的影響

從圖3可知，當(dāng)磁性納米顆粒質(zhì)量濃度在20 mg/mL時，固定化酶的酶活回收率最大，但當(dāng)磁性納米顆粒濃度繼續(xù)增加，固定化酶的酶活回收率反而下降。這是由于當(dāng)TMOS量一定時，過多的磁性納米顆粒與酶分子競爭TMOS的空間，減少了酶分子在硅膠中包埋的數(shù)量，導(dǎo)致固定化酶酶活有所下降。

圖3 酶量對固定化酶酶活的影響Fig.3 Effects of nanopaticles concentration on activity

通過上述固定化酶制備條件的優(yōu)化，最終獲得的制備條件是2 mL濃度為0.8mol/L正硅酸甲酯水解液、1 mL濃度為20 mg/mL的磁性納米顆粒和酶添加量5 mL(0.86 U/mL)，在此條件下所得固定化酶的最大酶活回收率是52%。以前我們曾用交聯(lián)酶聚體(CLEAs)方法對PAL進(jìn)行固定化，結(jié)果最大酶活回收率是25%［10］，而用本方法制備的固定化酶酶活回收率是CLEAs方法的2.1倍。表明該方法是一種提高酶固定化效率的有效方法。

2.2 固定化PAL的形態(tài)觀察

圖4是掃描電鏡觀察的固定化PAL的圖片?？梢钥闯觯?00 nm標(biāo)尺下，固定化酶的顆粒非常小，形態(tài)不規(guī)則，分布不均勻，且結(jié)構(gòu)較為疏松(圖4a)，這種結(jié)構(gòu)有利于酶促反應(yīng)過程中底物和產(chǎn)物的傳遞。透射電鏡表明，磁性納米顆粒已經(jīng)被成功的包埋在硅膠中(箭頭所指為包埋的磁性納米顆粒)(圖4b)。熒光圖片顯示，標(biāo)記有FITC的酶蛋白在硅膠中發(fā)出綠光(圖4c)，表明酶蛋白已經(jīng)被成功包埋在硅膠中。

圖4 固定化酶的形態(tài)Fig.4 Morphology of immobilized PAL

2.3 固定化PAL催化穩(wěn)定性

2.3.1 固定化PAL溫度穩(wěn)定性

固定化PAL的溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化酶具有更高的耐受高溫的能力，在60℃下處理45 min時，游離酶基本損失了大部分的酶活，而固定化酶還能保持30%左右的酶活，當(dāng)處理1 h后，游離酶幾乎喪失了所有酶活，而固定化酶卻還能保留20%以上的酶活，說明當(dāng)酶分子被包埋在仿生氧化硅中后，酶分子的天然空間構(gòu)象得以保持［11］，特別是由于有氧化硅的外層保護(hù)下，溫度的傳遞速度減緩，保護(hù)了硅膠內(nèi)的酶分子，使高的溫度不能直接作用于酶分子，降低了酶的失活速率。

圖5 固定化PAL的溫度穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of encapsulated PAL

2.3.2 固定化酶pH穩(wěn)定性

固定化酶pH的穩(wěn)定性結(jié)果如圖6所示。與游離酶相比，固定化酶在pH 2～5時表現(xiàn)出較高的耐受性，但趨向于強(qiáng)堿條件時，固定化酶活損失較大，而游離酶卻能保留較高的酶活，在pH是11的條件下處理30 min，游離酶能保留42%的酶活，而固定化酶僅能保持13%的酶活。表明游離的PAL具有較強(qiáng)的耐受強(qiáng)堿的能力，但固定化所形成的硅膠在強(qiáng)堿條件下易分解［3］，導(dǎo)致包埋在硅膠中的PAL分子泄漏到溶液中，從而使固定化酶中的PAL數(shù)量減少，表現(xiàn)為固定化酶的酶活殘留率下降。

圖6 固定化PAL的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH-stability of encapsulated PAL

2.3.3 固定化酶變性劑穩(wěn)定性

固定化酶對變性劑的穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，在變性劑作用下，游離酶和固定化酶都有不同程度的失活，但固定化酶表現(xiàn)出對變性劑更高的耐受性，特別是當(dāng)用6 mol/L尿素處理30 min后，游離酶基本失活，只能殘留4%的酶活，但固定化酶還能留持24%的酶活。固定化酶對變性劑的耐受可能是由于游離的酶分子被包埋在仿生氧化硅載體中，氧化硅載體阻礙了變性劑與酶分子的直接接觸，使酶分子的活性結(jié)構(gòu)得以保持，導(dǎo)致酶活被保留下來［13-14］。

2.3.4 固定化酶儲存穩(wěn)定性

圖7 固定化PAL的變性劑穩(wěn)定性Fig.7 Encapsulated PAL against denaturants

固定化酶的儲存穩(wěn)定性是評價固定化酶應(yīng)用價值的重要指標(biāo)［15］。固定化PAL儲存穩(wěn)定性結(jié)果如圖8所示。在儲存過程中，游離酶和固定化酶酶活都有所下降，但固定化酶儲存穩(wěn)定性要顯著好于游離酶，在儲存到第18天，游離酶已經(jīng)基本失活，但固定化酶還能保留38%的酶活。說明PAL經(jīng)過仿生硅化固定化后儲存穩(wěn)定性有顯著改善。

圖8 固定化PAL的儲存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of encapsulated PAL

2.4 固定化PAL重復(fù)使用性

固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，經(jīng)過仿生硅化包埋的PAL具有一定的重復(fù)使用穩(wěn)定性，連續(xù)重復(fù)使用7次后固定化酶還能保留近20%的酶活，但是，無磁性納米顆粒的仿生硅固定化PAL在使用到第7輪時，固定化酶基本檢測不到酶活［16］，表明磁性納米顆粒的加入有助于固定化酶的重復(fù)使用。但重復(fù)使用的效果還是不明顯，這可能是由于在反復(fù)回收過程中，包埋在硅膠中的PAL有一定的泄露，導(dǎo)致酶活損失。

圖9 固定化酶重復(fù)使用穩(wěn)定性Fig.9 Recycling stability of encapsulated PAL

3 結(jié)論

本研究首次利用仿生硅化過程將PAL酶和磁性納米顆粒共同包埋在硅膠中，所得磁性固定化酶的最佳制備條件是:2 mL濃度為0.8 mol/L正硅酸甲酯水解液、1 mL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的磁性納米顆粒和酶添加量5 mL(0.86 U/mL)時，所得固定化酶的最大酶活回收率是52%。與游離酶相比，固定化酶表現(xiàn)出較好的溫度、pH、變性劑和儲存穩(wěn)定性，此外，固定化酶還具有一定的重復(fù)使用穩(wěn)定性，在連續(xù)重復(fù)使用7批次后，固定化酶還能保持初始酶活的近20%。上述結(jié)果表明這種固定化酶方法在工業(yè)應(yīng)用中具有較好的實用前景。

［1］ 賀立紅，張進(jìn)標(biāo)，賓金華.苯丙氨酸解氨酶的研究進(jìn)展［J］.食品科技，2006(7):31-34.

［2］ 崔建東，李艷，牟德華.苯丙氨酸解氨酶(PAL)的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(7):306-308.

［3］ Kuan I C，Wu J Ch，Lee Sh L，et al.Stabilization of D-amino acid oxidase from Rhodosporidium toruloides by encapsulation in polyallylamine-mediated biomimetic silica［J］.Biochemical Engineering Journal，2010，49(3):408-413.

［4］ 王靜云，馬翠麗，包永明.脂肪酶仿生固定化及性質(zhì)［J］.分子催化，2011，25(4):341-347.

［5］ CUI J D，ZHANG S，SUN L M.Cross-linked enzyme aggregates of phenylalanine ammonia lyase:novel biocatalysts for synthesis of L-phenylalanine［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，167(4):835-844.

［6］ Forsyth C，Yip T W S，Siddharth V，et al.CO2sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica［J］.Chemical Communications，2013，49(31):3 191-3 193.

［7］ CUI J D，CUI L L，ZHANG S P，et al.Hybrid magnetic cross-linked enzyme aggregates of phenylalanine ammonia lyase from Rhodotorula glutinis［J］.PLoS ONE，2014，9(5):e97221.

［8］ 江柯.粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)CIBAS A1401苯丙氨酸解氨酶(PAL)的分離純化與性質(zhì)研究［D］.成都:四川大學(xué)，2004.

［9］ 李連連，崔建東.以大孔硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體的制備及性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35(11):160-165.

［10］ 孫立梅，李連連，崔建東.牛血清白蛋白輔助交聯(lián)對苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體影響的研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(13):66-69.

［11］ WANG J Y，MA C L，BAO Y M，et al.Lipase entrapment in protamine-induced bio-zirconia particles:characterization and application to the resolution of(R，S)-1-phenylethanol［J］.Enzyme and Microbial Technology，2012，51(1):40-46.

［12］ Kroger N，Lorenz S，Brinner E.Self-assembly of highly phosphorylated silaffins and their function in biosilica morphogenesis［J］.Science，2002，298:584-586.

［13］ 李林.仿生氧化硅凝膠固定化D-葡萄糖醛酸苷酶的研究［D］.天津:天津大學(xué)，2008.

［14］ ZHOU Y L，WANG C，JIANG Y J，et al.Immobilization of papain in biosilica matrix and its catalytic property ［J］.Chinese Journal of Chemical Engineering，2013，21(6):670-675.

［15］ 張羽飛.仿生固定化酶制備及其催化特性研究［D］.天津:天津大學(xué)，2008.

［16］ CUI JD，LIANG L H，HAN C，et al.Stabilization of phenylalanine ammonia lyase from Rhodotorula glutinis by encapsulation in polyethyleneimine-mediated biomimetic silica［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2015，DOI:10.1007/s12010-015-1624-0.