環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的假陽性擴(kuò)增研究

王德國，王永真，王愛萍

(1．許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南省博士后研發(fā)基地，河南許昌461000;2．許昌學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)中心，河南 許昌461000;3．鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450000)

日本學(xué)者Notomi等2000年發(fā)明報(bào)道了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［1］，據(jù)谷歌統(tǒng)計(jì)截至目前該報(bào)道已被引用2146次，該技術(shù)通過多對(duì)引物巧妙實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)效率非常高，因?yàn)闊o溫度變化的耗時(shí)，后來環(huán)引物的提出進(jìn)一步縮短了反應(yīng)時(shí)間［2］，因此環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在反應(yīng)速度、特異性、靈敏度方面優(yōu)于鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)［3，4］、酸序列依賴性擴(kuò)增(NASBA)［5，6］、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)［7］、滾換擴(kuò)增反應(yīng)(RCA)［8］和解鏈酶擴(kuò)增(HAD)［9］，然而，在科技成果快速轉(zhuǎn)化的當(dāng)今時(shí)代，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)經(jīng)過十多年的研究開發(fā)，仍然沒有實(shí)際應(yīng)用，主要由于這種核酸擴(kuò)增檢測方法假陽性率高，本研究旨在研究分析引起假陽性擴(kuò)增的主要原因，為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)．

按照Notomi等2000年所報(bào)道的試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物，以相同的反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件開展實(shí)驗(yàn)，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與所報(bào)道的完全不同．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1．1 引物

采用Notomi等報(bào)道中針對(duì)M13的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，由生物工程(上海)有限公司合成，如表1所示．

表1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物

1．2 DNA 模板

實(shí)驗(yàn)室沒有M13DNA模板，因此，在本研究中也就不存在模板引起的氣溶膠污染及交叉污染問題．

1．3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)

按照Notomi等報(bào)道的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，只是所有的反應(yīng)管中均不加DNA模板，加入不同引物組合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP;F3+B3)各種引物的濃度與Notomi等報(bào)道的相同，擴(kuò)增后2%的瓊脂糖凝膠電泳，重復(fù)三次．

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，其中四種引物組合(FIP+BIP+F3+B3;FIP+BIP+F3;FIP+BIP+B3;FIP+BIP)均能非特異擴(kuò)增，并且具有典型的LAMP梯度條帶，而Notomi等報(bào)道的試驗(yàn)中陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增，并且沒有典型的LAMP梯度條帶［1］．

目前該領(lǐng)域的科研工作者普遍認(rèn)為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)靈敏度高，容易產(chǎn)生氣溶膠污染，交叉污染是導(dǎo)致假陽性率高的主要原因，在實(shí)現(xiàn)不開蓋檢測方面做了大量研究與嘗試，如濁度法檢測［10］、實(shí)時(shí)濁度法檢測［11］、熒光染料檢測［12-14］、免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰垯z測［15］、使用指示劑羥基萘酚藍(lán)檢測［16，17］以及日本榮研公司的鈣黃綠素檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測手段近乎非常完美，但不開蓋檢測并沒有把環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增推向?qū)嶋H應(yīng)用，正如本研究結(jié)果所表明的，引起環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增假陽性的主要原因不是氣溶膠污染，而是引物的非特異性擴(kuò)增．環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增通過多對(duì)引物實(shí)現(xiàn)巧妙擴(kuò)增，使用多對(duì)引物難免會(huì)形成引物二聚體和出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，特別是在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中引物、鎂離子、dNTP和酶的濃度比Real-time PCR中的高好幾倍，在Real-time PCR研究中，為了避免非特性擴(kuò)增需要嚴(yán)格控制這四個(gè)因素的濃度．在本研究中，甚至一對(duì)內(nèi)引物就可以非特異性擴(kuò)增，因此，目前環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)只是理想的分子模型，在該技術(shù)的應(yīng)用研究中應(yīng)致力于解決非特異性擴(kuò)增問題．

圖1 不加模板的情況下環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)推廣應(yīng)用的瓶頸是假陽性率高，導(dǎo)致假陽性率高的主要原因是引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，其次是氣溶膠污染．本研究的創(chuàng)新之處在于首次發(fā)現(xiàn)限制環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)推廣應(yīng)用的真正原因所在．

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