枯草芽孢桿菌對海南長臀鮠生長性能、血清生化指標(biāo)和熱休克蛋白HSP70的影響

呂子君 ， 李正光 ，2， 謝 駿 ， 謝少林 ， 王 超 ， 鄒記興 *

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642；2.清遠(yuǎn)市北江水產(chǎn)研究所，廣東清遠(yuǎn) 511510；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081）

長臀鮠（Cranoglanis bouderius）是鲇形目中名貴的養(yǎng)殖魚類，屬于長臀鮠科，長臀鮠屬，享有“淡水之王”的美譽(yù)，具有重要的開發(fā)利用價(jià)值，已被列入中國瀕危動(dòng)物紅皮書（黃衛(wèi)盛等，2005）。海南長臀鮠（Cranoglanis bouderius multiradiatus）已被海南省列為二級保護(hù)動(dòng)物。在人工養(yǎng)殖條件下，長臀鮠生長發(fā)育的適應(yīng)性一直是難點(diǎn)問題，主要表現(xiàn)在養(yǎng)殖技術(shù)不規(guī)范，成活率低，飼料系數(shù)高，經(jīng)濟(jì)效益差。目前對長臀鮠的研究主要集中在其物種有效性、資源和激素調(diào)控方面的內(nèi)容，關(guān)于長臀鮠血液生理生化和免疫方面的研究較少。因此，本試驗(yàn)研究了枯草芽孢桿菌對海南長臂鮠生長性能、血液生理生化指標(biāo)及HSP70的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 參照黃顙魚（DB35T 1054-2010）和長吻鮠（SC/T 1072-2006）的配合飼料標(biāo)準(zhǔn)，以進(jìn)口魚粉、次粉、豆粕、棉籽粕、α-淀粉等為原料，配制基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別加入0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%（活菌數(shù)分別為 3×108、6×108、9×108、1.2×109cfu/g）的枯草芽孢桿菌。各種原料充分混勻后，再制成粒徑為1.2 mm的顆粒飼料，50℃烘至水分大約為10%后密封冷藏保存?；A(chǔ)飼料組成及5組飼料主要營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料原料組成及營養(yǎng)水平 %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 枯草芽孢桿菌由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心研制。長臀鮠魚種由清遠(yuǎn)市興漁水產(chǎn)有限公司提供。選擇平均尾重為 （5.79±0.02）g的健康試驗(yàn)魚馴養(yǎng) 7 d后，隨機(jī)分為5組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾魚，以重復(fù)為單位分別放入15個(gè)循環(huán)流水的水族缸內(nèi)，試驗(yàn)期為60 d。

長臀鮠投喂量占魚體重的3%，每天投喂3次，在 8∶00、12∶00 和 16∶00 各投喂一次，每天早上進(jìn)行吸污。整個(gè)試驗(yàn)期間平均水溫（26.5±1.3）℃，溶氧≥6 mg/L，pH為6.8～7.7，氨氮≤0.04 mg/L，亞硝酸鹽≤0.01 mg/L。

1.3 采樣與測定方法 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停飼24 h，對各池魚進(jìn)行稱重和計(jì)數(shù)，計(jì)算增重率（WGR）、肥滿度 （CF）、特定生長率 （SGR）和餌料系數(shù)（FCR）。每個(gè)水族缸中隨機(jī)抽取10尾長臀鮠采血、量體長等指標(biāo)。魚體釆血后于冰盤上解剖，每缸魚取50 g左右的背肌用于肉質(zhì)分析。取約0.1 g肝臟用液氮速凍后于-80℃保存用于熱休克基因70（HSP70）含量測定。

1.3.1 血清生化指標(biāo)測定 血樣常溫靜置2 h后，4℃、10000 r/min離心5 min制備血清，-20℃凍存，用于測定血清生化指標(biāo)。血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（AKP）、血糖（GLU）、甘油三酯 （TG）、 丙二醛 （MDA）、 過氧化氫酶（CAT）試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所；總膽固醇（T-CHOL），均購于北京北化康泰臨床試劑有限公司，測定方法按試劑盒使用說明操作。

1.3.2 生長性能指標(biāo)測定 分別按下式計(jì)算增重率、特定生長率、餌料系數(shù)、肥滿度：

增重率/%=（Wt-Wo）/Wo×100；

特定生長率/（%/d）=（Ln Wt-Ln Wo）/t×100；

餌料系數(shù)=FI/（Wt-Wo）；

肥滿度/%=Wt/L3×100；

式中：Wo為試驗(yàn)初魚體均重，g；Wt為試驗(yàn)?zāi)~體均重，g；t為飼喂天數(shù)，d；FI每尾魚平均攝食總量（風(fēng)干樣重），g；L為試驗(yàn)?zāi)┢骄~體長，cm。

1.3.3 HSP70引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer 5.0，根據(jù)NCBI上已有鲇形目HSP70序列 （斑點(diǎn)胡子鯰HM044876.1、胡子鯰LC013677.1、斑點(diǎn)叉尾鮰U22460.1）設(shè)計(jì)引物 PHSP70F、PHSP70R，擴(kuò)增得到保守序列后設(shè)計(jì)熒光定量引物PHSP70RF、PHSP70RR，內(nèi)參基因選擇β-actin，根據(jù)已有鲇形目β-actin序列 （黃顙魚 EU161065.2、克林雷氏KC195970.1、長吻鮠 JN833583.1、革胡子鯰KJ722166.1、胡子鯰 EU527190.2）設(shè)計(jì)長臀鮠內(nèi)參定量引物 Pβ-actinRF、Pβ-actinRR，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，擴(kuò)增的序列片段的大小為100～150 bp。引物具體見表2。

表2 基因表達(dá)的引物

1.3.4 SYBR熒光定量RT-PCR的步驟 每0.05 g肝臟組織加入1mL Trizol，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄cDNA，參照慈麗寧（2011）的方法。本試驗(yàn)采用相對定量的方法，以對照組為基準(zhǔn)，選擇p-actin為內(nèi)標(biāo)，以校正所加的cDNA量。擴(kuò)增反應(yīng)釆用了SYBR GreenⅡ嵌合突光法，cDNA稀釋20倍，反應(yīng)程序?yàn)椋海?）95 ℃、30 s；（2）95℃、5 s；（3）60 ℃、30 s；（4）95 ℃、15 s；（5）60 ℃、1min；（6）95 °C、15 s。

其中第二到第三步共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，四五步制作溶解曲線。

反應(yīng)體系為 20 μL，其中 SYBR GreenⅡ 10 μL、PrimerF 0.8 μL、PrimerR 0.8 μL、Rox Dye 0.4 μL、H2O 4 μL、cDNA 4 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA分析數(shù)據(jù)，選用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示（置信區(qū)間為0.95）。熒光定量PCR檢測結(jié)果導(dǎo)出后，采用用 2-△△Ct法，用 SPSS 16.0 來計(jì)算 HSP 70的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對長臀鮠生長性能的影響由表3可知，添加枯草芽孢桿菌對長臀鮠的存活率無顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)枯草芽孢桿菌的添加量超過0.6%時(shí)，終末體重顯著提高，其中0.9%組和1.2%組分別比對照組提高了21.97%和23.14%（P＜0.05）。增重率和特定生長率也以0.9%組、1.2%組最高，分別較對照組提高36.62%、39.24%（P ＜ 0.05）和 20.92%、22.88%（P ＜ 0.05）。隨著枯草芽孢桿菌添加水平的提高，各組的餌料系數(shù)分別比對照組下降了 16.67%（P＞0.05）、16.67%（P ＞ 0.05）、23.91%（P ＜ 0.05）、26.81%（P ＜ 0.05），肥滿度則出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但各試驗(yàn)組與對照組差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 枯草芽孢桿菌對長臀鮠生長性能的影響

2.2 枯草芽孢桿菌對長臀鮠血清生化指標(biāo)的影響 由表4可知，本試驗(yàn)是否添加枯草芽孢桿菌對長臀鮠血清葡萄糖的影響不顯著 （P＞0.05）。各試驗(yàn)組血清總蛋白比對照組分別顯著提高了7.90%、7.61%、4.83%和 12.69%（P＜0.05）。 添加芽孢桿菌對白蛋白有提高的作用，其中以0.3%組和0.6%組最高（P＜0.05）。堿性磷酸酶有提高的趨勢，但組間差異不顯著（P＞0.05）。1.2%組甘油三酯和總膽固醇均顯著降低（P＜0.05），但0.3%組的甘油三酯含量更低 （P＜0.05）。試驗(yàn)組丙二醛含量與對照組差異不顯著（P＜0.05），血清過氧化氫含量以0.9%組的活性最高，比對照組提高了41.89%（P ＜ 0.05）。

表4 枯草芽孢桿菌對長臀鮠血清生化指標(biāo)的影響

2.3 枯草芽孢桿菌對長臀鮠HSP70表達(dá)量的影響 由圖1可知，在本研究的添加量范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌的添加量越大，對HSP70表達(dá)量的影響越大。各組長臀鮠檢出的HSP70表達(dá)量分別為1.09、1.21、1.43、1.53、2.41， 試驗(yàn)組比對照組分別提 高 了 11.01% （P ＞ 0.05）、31.19% （P ＜ 0.05）、40.37%（P ＜ 0.05）和 121.10%（P ＜ 0.05）。

3 討論

研究表明，枯草芽孢桿菌能降低中華絨螯蟹餌料系數(shù)，提高增重率，增強(qiáng)免疫力和抗病力（陳文典等，2009）。沈斌乾等（2013）研究表明，是否添加枯草芽孢桿菌對青魚的存活率影響不顯著。胡凡光等（2014）和沈文英等（2011）對草魚分別添加1‰、2‰枯草芽孢桿菌的研究結(jié)果顯示，增重率和特定生長率比對照組有顯著提高。胡凡光等（2014）在大菱鲆飼料中添加5‰的芽孢桿菌飼養(yǎng)40 d，顯著降低了飼料系數(shù)。本試驗(yàn)在0.9%和1.2%添加量時(shí)，對長臀鮠的研究與上述結(jié)果相似。但有研究表明，在網(wǎng)箱養(yǎng)殖鯉時(shí)添加2‰的芽孢桿，對增重率和餌料利用率有所下降（江萍等，1997）。

一般情況下，魚類的血液指標(biāo)是相對穩(wěn)定的，并且可以反映魚體生理和營養(yǎng)狀況 （林浩然，1999）。血脂水平可反映全身脂類物質(zhì)的代謝狀況（Hiraoka等，1979）。已有研究表明，芽孢桿菌具有緩解脂質(zhì)過氧化的作用，還能清除機(jī)體羥自由基及提高CAT活性 （程遠(yuǎn)等，2014；沈文英等，2009）。血漿中的AKP與脂肪、糖類和蛋白質(zhì)的吸收與運(yùn)輸關(guān)系密切（洪寧等，2007）。CAT可以分解氫氧自由基和過氧化氫，在調(diào)節(jié)細(xì)胞免于活性氧的氧化損傷過程中起著重要的作用（瞿建宏等，2006；魯雙慶等，2002）。MDA能一定程度上反映脂質(zhì)的過氧化程度和細(xì)胞損傷程度，在血清中的含量往往與SOD活性相對立。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加芽孢桿菌能提高TP、ALB和CAT水平，維持血糖水平，降低TG、T-CHOL水平。在本試驗(yàn)的添加范圍內(nèi)，AKP有一定的提高，MDA有下降的趨勢，但與對照組相比差異不顯著，這與沈文英（2011）對草魚研究的結(jié)果有所不同。這可能與添加的菌株、添加量、養(yǎng)殖對象和養(yǎng)殖周期有關(guān)。

熱休克蛋白（HSPs），又稱熱應(yīng)激蛋白，是機(jī)體抗逆能力的表現(xiàn)（Basu等，2002）。HSP70s是其中最保守和最重要的一族，主要與抗應(yīng)激、提高細(xì)胞生存能力和提高對環(huán)境的耐受性有關(guān)（Ming等，2012）。利用添加劑來調(diào)控機(jī)體HSP70水平來實(shí)現(xiàn)提高抗應(yīng)激能力已成為研究熱點(diǎn)。有研究表明HSP70可通過反饋抑制作用減少氧自由基的產(chǎn)生，提高內(nèi)源性過氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）水平，從而加快氧自由基的清除（張紅波等，2009）。研究發(fā)現(xiàn)，大黃等中草藥能提高水生動(dòng)物HSP70的合成（崔素麗等，2013；雷愛瑩和曾地剛，2008）。本研究結(jié)果說明枯草芽孢桿菌對長臀鮠HSP70的合成起促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可提高長臀鮠增重率和特定生長率，降低餌料系數(shù)，提高血液蛋白水平，降血脂，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力?？莶菅挎邨U菌作為飼料添加劑對水生動(dòng)物的作用效果已逐漸被證實(shí)。目前對枯草芽孢桿菌的研究主要是圍繞生長性能、免疫、消化酶和抗氧化能力開展的，對于抗應(yīng)激方面的研究甚少。如果能結(jié)合熱休克蛋白和其他性能進(jìn)行研究，則會(huì)進(jìn)一步揭示枯草芽孢桿菌的作用機(jī)理，從而大大推進(jìn)枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)上的應(yīng)用。本研究建議枯草芽孢桿菌添加量為0.9%～1.2%。

[1]陳文典，李義，郝向舉，等.枯草芽孢桿菌微膠囊制劑對中華絨螯蟹免疫機(jī)能及抗病力的影響[J].中國飼料，2009，5：33 ～ 36.

[2]程遠(yuǎn)，黃凱，黃秀蕓，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對吉富羅非魚生長性能、免疫力和抗氧化功能的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（6）：1 ～ 10.

[3]慈麗寧.藻粉替代魚粉對團(tuán)頭魴生長性能、營養(yǎng)成分、消化機(jī)能和免疫的影響：[碩士學(xué)位論文][D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[4]崔素麗，劉波，徐跑，等.兩種溫度下大黃素對團(tuán)頭魴生長、血液指標(biāo)及肝臟 HSP70 mRNA 表達(dá)的影響.[J]水生生物學(xué)報(bào)，2013，37（5）：919 ～ 928.

[5]洪寧，胡信雷，耿春輝.活血通絡(luò)中藥復(fù)方對家兔骨折后血清堿性磷酸酶、鈣、磷的影響[J].淮海醫(yī)藥，2007，25（5）：420 ～ 424.

[6]胡凡光，郭萍萍，麻丹萍，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對促進(jìn)大菱鲆生長及養(yǎng)殖水環(huán)境的影響[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2014，41（2）：7 ～ 11.

[7]黃衛(wèi)盛，謝俊剛，蘇怡林，等.珠江長臀鮠的生物學(xué)特性研究[J].水產(chǎn)科技，2005，3：36 ～ 37.

[8]江萍，夏先林，周碧君，等.兩種微生態(tài)調(diào)節(jié)劑對網(wǎng)箱鯉 魚 生 產(chǎn) 效 果的 影 響 [J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，1997，9（3）：26 ～ 28.

[9]瞿建宏，陳家長，胡庚東，等.苯酚脅迫下羅非魚組織中過氧化氫酶與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)態(tài)變化[J].生態(tài)環(huán)境 2006，15（4）：687 ～ 692.

[10]雷愛瑩，曾地剛.復(fù)方中草藥對凡納濱對蝦熱應(yīng)激蛋白70基因表達(dá)的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，9（6）：830 ～ 833.

[11]林浩然.魚類生理學(xué)[M].廣州：廣東高等教育出版社，1999.185～188.

[12]魯雙慶，劉少軍，劉紅玉.Cu2+對黃鱔肝臟保護(hù)酶 SOD、CAT、GSH-PX活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2002，2：l38 ～ 141.

[13]沈斌乾，陳建明，郭建林，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對青魚生長消化酶活性和魚體組成的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，2013，37（1）：48 ～ 53.

[14]沈文英，李衛(wèi)芬，梁權(quán)，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚生長性能免疫和抗氧化功能的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào).2011，23（5）：881 ～ 886.

[15]沈文英，余東游，李衛(wèi)芬，等.地衣芽孢桿菌對三角帆蚌消化酶活性、免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009，21（1）：95 ～ 100.

[16]張紅波，萬亞濤，王蓮哲，等.在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中HSP70的保護(hù)與調(diào)節(jié)作用[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2009，14（4）：228 ～ 229.

[17]Basu N，Todgham A E，Ackerman P A，et al.Heat shock protein genes and their functional significance in fish[J].Gene，2002，295（2）：173 ～ 183.

[18]DB35/T 1054-2010黃顙魚配合飼料[S].

[19]Hiraoka Y，Nakagawa H，Murachi S，et al.Blood properties of rainbow trout in acute hepatotoxity （sic）by carbon tetrachloride[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1979，45（4）：527 ～ 532.

[20]Ming J H，Xie J，Xu P，et al.Effects of emodin and vitamin C on growth performance，biochemical parameters and two HSP70s mRNA expression of Wuchang bream （Megalobrama amblycephala Yih）under high temperature stress[J].Fish&Shellfish Immunology，2012，32（5）：651 ～ 661.

[21]SC/T 1072-2006長吻鮠配合飼料[S].