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    枯草芽孢桿菌對海南長臀鮠生長性能、血清生化指標(biāo)和熱休克蛋白HSP70的影響

    2015-12-25 01:52:00呂子君李正光謝少林鄒記興
    中國飼料 2015年11期
    關(guān)鍵詞:枯草芽孢桿菌

    呂子君 , 李正光 ,2, 謝 駿 , 謝少林 , 王 超 , 鄒記興 *

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510642;2.清遠(yuǎn)市北江水產(chǎn)研究所,廣東清遠(yuǎn) 511510;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,江蘇無錫 214081)

    長臀鮠(Cranoglanis bouderius)是鲇形目中名貴的養(yǎng)殖魚類,屬于長臀鮠科,長臀鮠屬,享有“淡水之王”的美譽(yù),具有重要的開發(fā)利用價(jià)值,已被列入中國瀕危動(dòng)物紅皮書(黃衛(wèi)盛等,2005)。海南長臀鮠(Cranoglanis bouderius multiradiatus)已被海南省列為二級保護(hù)動(dòng)物。在人工養(yǎng)殖條件下,長臀鮠生長發(fā)育的適應(yīng)性一直是難點(diǎn)問題,主要表現(xiàn)在養(yǎng)殖技術(shù)不規(guī)范,成活率低,飼料系數(shù)高,經(jīng)濟(jì)效益差。目前對長臀鮠的研究主要集中在其物種有效性、資源和激素調(diào)控方面的內(nèi)容,關(guān)于長臀鮠血液生理生化和免疫方面的研究較少。因此,本試驗(yàn)研究了枯草芽孢桿菌對海南長臂鮠生長性能、血液生理生化指標(biāo)及HSP70的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)飼料 參照黃顙魚(DB35T 1054-2010)和長吻鮠(SC/T 1072-2006)的配合飼料標(biāo)準(zhǔn),以進(jìn)口魚粉、次粉、豆粕、棉籽粕、α-淀粉等為原料,配制基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別加入0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%(活菌數(shù)分別為 3×108、6×108、9×108、1.2×109cfu/g)的枯草芽孢桿菌。各種原料充分混勻后,再制成粒徑為1.2 mm的顆粒飼料,50℃烘至水分大約為10%后密封冷藏保存?;A(chǔ)飼料組成及5組飼料主要營養(yǎng)水平見表1。

    表1 基礎(chǔ)飼料原料組成及營養(yǎng)水平 %

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 枯草芽孢桿菌由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心研制。長臀鮠魚種由清遠(yuǎn)市興漁水產(chǎn)有限公司提供。選擇平均尾重為 (5.79±0.02)g的健康試驗(yàn)魚馴養(yǎng) 7 d后,隨機(jī)分為5組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)50尾魚,以重復(fù)為單位分別放入15個(gè)循環(huán)流水的水族缸內(nèi),試驗(yàn)期為60 d。

    長臀鮠投喂量占魚體重的3%,每天投喂3次,在 8∶00、12∶00 和 16∶00 各投喂一次,每天早上進(jìn)行吸污。整個(gè)試驗(yàn)期間平均水溫(26.5±1.3)℃,溶氧≥6 mg/L,pH為6.8~7.7,氨氮≤0.04 mg/L,亞硝酸鹽≤0.01 mg/L。

    1.3 采樣與測定方法 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,停飼24 h,對各池魚進(jìn)行稱重和計(jì)數(shù),計(jì)算增重率(WGR)、肥滿度 (CF)、特定生長率 (SGR)和餌料系數(shù)(FCR)。每個(gè)水族缸中隨機(jī)抽取10尾長臀鮠采血、量體長等指標(biāo)。魚體釆血后于冰盤上解剖,每缸魚取50 g左右的背肌用于肉質(zhì)分析。取約0.1 g肝臟用液氮速凍后于-80℃保存用于熱休克基因70(HSP70)含量測定。

    1.3.1 血清生化指標(biāo)測定 血樣常溫靜置2 h后,4℃、10000 r/min離心5 min制備血清,-20℃凍存,用于測定血清生化指標(biāo)。血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(AKP)、血糖(GLU)、甘油三酯 (TG)、 丙二醛 (MDA)、 過氧化氫酶(CAT)試劑盒,均購于南京建成生物工程研究所;總膽固醇(T-CHOL),均購于北京北化康泰臨床試劑有限公司,測定方法按試劑盒使用說明操作。

    1.3.2 生長性能指標(biāo)測定 分別按下式計(jì)算增重率、特定生長率、餌料系數(shù)、肥滿度:

    增重率/%=(Wt-Wo)/Wo×100;

    特定生長率/(%/d)=(Ln Wt-Ln Wo)/t×100;

    餌料系數(shù)=FI/(Wt-Wo);

    肥滿度/%=Wt/L3×100;

    式中:Wo為試驗(yàn)初魚體均重,g;Wt為試驗(yàn)?zāi)~體均重,g;t為飼喂天數(shù),d;FI每尾魚平均攝食總量(風(fēng)干樣重),g;L為試驗(yàn)?zāi)┢骄~體長,cm。

    1.3.3 HSP70引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer 5.0,根據(jù)NCBI上已有鲇形目HSP70序列 (斑點(diǎn)胡子鯰HM044876.1、胡子鯰LC013677.1、斑點(diǎn)叉尾鮰U22460.1)設(shè)計(jì)引物 PHSP70F、PHSP70R,擴(kuò)增得到保守序列后設(shè)計(jì)熒光定量引物PHSP70RF、PHSP70RR,內(nèi)參基因選擇β-actin,根據(jù)已有鲇形目β-actin序列 (黃顙魚 EU161065.2、克林雷氏KC195970.1、長吻鮠 JN833583.1、革胡子鯰KJ722166.1、胡子鯰 EU527190.2)設(shè)計(jì)長臀鮠內(nèi)參定量引物 Pβ-actinRF、Pβ-actinRR,所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成,擴(kuò)增的序列片段的大小為100~150 bp。引物具體見表2。

    表2 基因表達(dá)的引物

    1.3.4 SYBR熒光定量RT-PCR的步驟 每0.05 g肝臟組織加入1mL Trizol,提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄cDNA,參照慈麗寧(2011)的方法。本試驗(yàn)采用相對定量的方法,以對照組為基準(zhǔn),選擇p-actin為內(nèi)標(biāo),以校正所加的cDNA量。擴(kuò)增反應(yīng)釆用了SYBR GreenⅡ嵌合突光法,cDNA稀釋20倍,反應(yīng)程序?yàn)椋海?)95 ℃、30 s;(2)95℃、5 s;(3)60 ℃、30 s;(4)95 ℃、15 s;(5)60 ℃、1min;(6)95 °C、15 s。

    其中第二到第三步共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),四五步制作溶解曲線。

    反應(yīng)體系為 20 μL,其中 SYBR GreenⅡ 10 μL、PrimerF 0.8 μL、PrimerR 0.8 μL、Rox Dye 0.4 μL、H2O 4 μL、cDNA 4 μL。

    1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA分析數(shù)據(jù),選用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(置信區(qū)間為0.95)。熒光定量PCR檢測結(jié)果導(dǎo)出后,采用用 2-△△Ct法,用 SPSS 16.0 來計(jì)算 HSP 70的表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 枯草芽孢桿菌對長臀鮠生長性能的影響由表3可知,添加枯草芽孢桿菌對長臀鮠的存活率無顯著影響(P>0.05)。當(dāng)枯草芽孢桿菌的添加量超過0.6%時(shí),終末體重顯著提高,其中0.9%組和1.2%組分別比對照組提高了21.97%和23.14%(P<0.05)。增重率和特定生長率也以0.9%組、1.2%組最高,分別較對照組提高36.62%、39.24%(P < 0.05)和 20.92%、22.88%(P < 0.05)。隨著枯草芽孢桿菌添加水平的提高,各組的餌料系數(shù)分別比對照組下降了 16.67%(P>0.05)、16.67%(P > 0.05)、23.91%(P < 0.05)、26.81%(P < 0.05),肥滿度則出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,但各試驗(yàn)組與對照組差異均不顯著(P>0.05)。

    表3 枯草芽孢桿菌對長臀鮠生長性能的影響

    2.2 枯草芽孢桿菌對長臀鮠血清生化指標(biāo)的影響 由表4可知,本試驗(yàn)是否添加枯草芽孢桿菌對長臀鮠血清葡萄糖的影響不顯著 (P>0.05)。各試驗(yàn)組血清總蛋白比對照組分別顯著提高了7.90%、7.61%、4.83%和 12.69%(P<0.05)。 添加芽孢桿菌對白蛋白有提高的作用,其中以0.3%組和0.6%組最高(P<0.05)。堿性磷酸酶有提高的趨勢,但組間差異不顯著(P>0.05)。1.2%組甘油三酯和總膽固醇均顯著降低(P<0.05),但0.3%組的甘油三酯含量更低 (P<0.05)。試驗(yàn)組丙二醛含量與對照組差異不顯著(P<0.05),血清過氧化氫含量以0.9%組的活性最高,比對照組提高了41.89%(P < 0.05)。

    表4 枯草芽孢桿菌對長臀鮠血清生化指標(biāo)的影響

    2.3 枯草芽孢桿菌對長臀鮠HSP70表達(dá)量的影響 由圖1可知,在本研究的添加量范圍內(nèi),枯草芽孢桿菌的添加量越大,對HSP70表達(dá)量的影響越大。各組長臀鮠檢出的HSP70表達(dá)量分別為1.09、1.21、1.43、1.53、2.41, 試驗(yàn)組比對照組分別提 高 了 11.01% (P > 0.05)、31.19% (P < 0.05)、40.37%(P < 0.05)和 121.10%(P < 0.05)。

    3 討論

    研究表明,枯草芽孢桿菌能降低中華絨螯蟹餌料系數(shù),提高增重率,增強(qiáng)免疫力和抗病力(陳文典等,2009)。沈斌乾等(2013)研究表明,是否添加枯草芽孢桿菌對青魚的存活率影響不顯著。胡凡光等(2014)和沈文英等(2011)對草魚分別添加1‰、2‰枯草芽孢桿菌的研究結(jié)果顯示,增重率和特定生長率比對照組有顯著提高。胡凡光等(2014)在大菱鲆飼料中添加5‰的芽孢桿菌飼養(yǎng)40 d,顯著降低了飼料系數(shù)。本試驗(yàn)在0.9%和1.2%添加量時(shí),對長臀鮠的研究與上述結(jié)果相似。但有研究表明,在網(wǎng)箱養(yǎng)殖鯉時(shí)添加2‰的芽孢桿,對增重率和餌料利用率有所下降(江萍等,1997)。

    一般情況下,魚類的血液指標(biāo)是相對穩(wěn)定的,并且可以反映魚體生理和營養(yǎng)狀況 (林浩然,1999)。血脂水平可反映全身脂類物質(zhì)的代謝狀況(Hiraoka等,1979)。已有研究表明,芽孢桿菌具有緩解脂質(zhì)過氧化的作用,還能清除機(jī)體羥自由基及提高CAT活性 (程遠(yuǎn)等,2014;沈文英等,2009)。血漿中的AKP與脂肪、糖類和蛋白質(zhì)的吸收與運(yùn)輸關(guān)系密切(洪寧等,2007)。CAT可以分解氫氧自由基和過氧化氫,在調(diào)節(jié)細(xì)胞免于活性氧的氧化損傷過程中起著重要的作用(瞿建宏等,2006;魯雙慶等,2002)。MDA能一定程度上反映脂質(zhì)的過氧化程度和細(xì)胞損傷程度,在血清中的含量往往與SOD活性相對立。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼料中添加芽孢桿菌能提高TP、ALB和CAT水平,維持血糖水平,降低TG、T-CHOL水平。在本試驗(yàn)的添加范圍內(nèi),AKP有一定的提高,MDA有下降的趨勢,但與對照組相比差異不顯著,這與沈文英(2011)對草魚研究的結(jié)果有所不同。這可能與添加的菌株、添加量、養(yǎng)殖對象和養(yǎng)殖周期有關(guān)。

    熱休克蛋白(HSPs),又稱熱應(yīng)激蛋白,是機(jī)體抗逆能力的表現(xiàn)(Basu等,2002)。HSP70s是其中最保守和最重要的一族,主要與抗應(yīng)激、提高細(xì)胞生存能力和提高對環(huán)境的耐受性有關(guān)(Ming等,2012)。利用添加劑來調(diào)控機(jī)體HSP70水平來實(shí)現(xiàn)提高抗應(yīng)激能力已成為研究熱點(diǎn)。有研究表明HSP70可通過反饋抑制作用減少氧自由基的產(chǎn)生,提高內(nèi)源性過氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)水平,從而加快氧自由基的清除(張紅波等,2009)。研究發(fā)現(xiàn),大黃等中草藥能提高水生動(dòng)物HSP70的合成(崔素麗等,2013;雷愛瑩和曾地剛,2008)。本研究結(jié)果說明枯草芽孢桿菌對長臀鮠HSP70的合成起促進(jìn)作用。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌可提高長臀鮠增重率和特定生長率,降低餌料系數(shù),提高血液蛋白水平,降血脂,增強(qiáng)抗應(yīng)激能力??莶菅挎邨U菌作為飼料添加劑對水生動(dòng)物的作用效果已逐漸被證實(shí)。目前對枯草芽孢桿菌的研究主要是圍繞生長性能、免疫、消化酶和抗氧化能力開展的,對于抗應(yīng)激方面的研究甚少。如果能結(jié)合熱休克蛋白和其他性能進(jìn)行研究,則會(huì)進(jìn)一步揭示枯草芽孢桿菌的作用機(jī)理,從而大大推進(jìn)枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)上的應(yīng)用。本研究建議枯草芽孢桿菌添加量為0.9%~1.2%。

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