芒柄花素保護前腦缺血再灌注損傷中的血腦屏障并抑制神經(jīng)炎癥

顧民華，洪 文，唐傳其，李 偉，顧 勇

（1．廣州市東升醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州510120；2．南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510515）

芒柄花素保護前腦缺血再灌注損傷中的血腦屏障并抑制神經(jīng)炎癥

顧民華1，洪 文1，唐傳其1，李 偉2，顧 勇2

（1．廣州市東升醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州510120；2．南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510515）

目的：觀察黃芪在腦缺血再灌注損傷模型中異黃酮成分“芒柄花素”對前腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障（BBB）的作用及抗神經(jīng)炎癥的效果．方法：大腦中動脈阻塞建立大鼠腦缺血模型，伊文思藍滲透實驗計算BBB通透性，原位明膠酶譜檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性以及熒光定量PCR檢測炎癥因子mRNA表達．結(jié)果：芒柄花素可顯著改善腦缺血再灌大鼠的神經(jīng)功能缺損和BBB通透性，降低MMP-9的表達、腦內(nèi)MMPs活性并減少誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素（IL-1β）等炎癥因子的mRNA在缺血腦片上的表達．結(jié)論：芒柄花素具有降低腦缺血再灌注損傷中的BBB通透性和抑制神經(jīng)炎癥的作用．

芒柄花素；黃芪；血腦屏障；神經(jīng)炎癥；腦缺血再灌注

第3次中國死亡原因調(diào)查顯示，腦血管病已經(jīng)超過了心血管疾病和惡性腫瘤成為中國第一死亡疾病，每年死亡人數(shù)超過200萬，死亡率是歐美國家的4～5倍，是日本的3．5倍［1］，具高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復發(fā)率等特點，嚴重威脅著國民的健康．急性腦卒中構(gòu)成中，大約3／4屬于缺血性腦卒中即腦梗死．隨著人口老齡化的到來，預防和治療腦梗死并試圖提高腦梗死的醫(yī)療質(zhì)量是整個醫(yī)學界迫切需要解決的問題［2］．

腦梗死治療在臨床上收效甚微，主要原因之一便是在腦梗死的不同發(fā)展階段具有不同的分子、細胞病理變化并引起更多加重病情發(fā)展的繼發(fā)性損傷，發(fā)生血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）開放、腦水腫等．缺血的早期階段BBB輕微開放，隨著病情發(fā)展，BBB損傷更嚴重，血液中的白蛋白等成分入腦實質(zhì)繼發(fā)神經(jīng)元死亡以及血管源性腦水腫［3－4］．因此，保護腦梗死病人的BBB損傷是治療的一個重要策略．

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix，metalloproteinases，MMPs）的激活破壞血管周邊基質(zhì)和內(nèi)皮細胞間的緊密連接，引起B(yǎng)BB開放進而發(fā)生出血轉(zhuǎn)化和神經(jīng)元死亡．包圍在缺血中心外面的缺血半暗帶接受相對低的血流灌注．低灌注誘發(fā)的剪應力、電子傳遞鏈干擾所形成的氧化應激以及低氧等因素共同啟動早期的炎癥反應，包括血小板聚集、小膠質(zhì)細胞激活、白細胞粘附和浸潤等［5］．而在亞急性期，缺血中心區(qū)組織受損后釋放一類“危險相關(guān)分子模式”的細胞內(nèi)含物大分子，結(jié)合相應的受體并激活炎癥細胞釋放多種炎性細胞因子如白介素1β（interleukin-1β，IL-1β），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）以及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthases，iNOS），從而啟動繼發(fā)的炎癥反應［6］．腦缺血再灌注過程中的早期與繼發(fā)的炎癥反應可以顯著地提高血腦屏障通透性，加劇神經(jīng)血管單元的損傷［7］．因此，以腦梗死過程中產(chǎn)生的炎癥反應作為治療靶點保護血腦屏障從而改善其癥狀是腦梗死治療的一個熱點方向［8］．

中藥黃芪來源于豆科植物黃芪（Astragalus membranaceus）的干燥塊根，有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用．芒柄花素又稱芒柄花黃素（formononetin，F(xiàn)MN）是其中一種活性成分，是異黃酮之一．有研究證實FMN具有清除自由基的作用［9］，對小鼠全腦缺血具有腦保護作用并降低腦水腫和腦內(nèi)炎癥［10］，體外研究表明FMN可以保護谷氨酸誘導的神經(jīng)元損傷［11］．本研究探討芒柄花素對缺血大鼠的神經(jīng)功能評分、BBB通透性、MMPs表達與活性以及神經(jīng)炎癥等的影響．

1 材料與方法

1．1 材料

芒柄花素購買自上海永恒生物制品有限公司；單股尼龍線栓購自美國強生公司；伊文思藍、二甲酰胺、DMSO、RIPA購自美國Sigma公司；EnzCheck膠原酶試劑盒、TRIzol購自美國Invitrogen；MMP-9購自Merck公司；β-actin抗體、羊抗鼠二抗購自Santa Cruz；ECL顯影液購自GE Healthcare；IL-1β、TNF-α、iNOS和β-actin的引物從華大基因公司購買．

1．2 方法

（1）動物分組、大鼠腦缺血與再灌注模型與給藥 雄性Sprague-Daweley（SD）大鼠，體質(zhì)量250～270 g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，動物證號：SYXK（粵）2020－0056．實驗大鼠30只，動物分組遵循隨機原則，分為兩部分：神經(jīng)功能評分和伊文思藍滲透實驗的實驗大鼠為15只，分別為假手術(shù)組（n＝3），溶劑對照組（n＝6），給藥組（n＝6）；另外15只實驗大鼠進行同樣分組，用于檢測MMPs活性和炎癥因子表達實驗．給藥、造模后分別取不同冠狀切面組織進行原位明膠酶譜、免疫印跡和熒光定量PCR實驗（圖1）．采用大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）作為腦缺血與再灌注模型［7］：大鼠經(jīng)苯巴比妥麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，消毒，沿頸中部切開暴露頸總、頸內(nèi)與頸外動脈；3／0的單股尼龍線栓從左側(cè)頸外切口插入，經(jīng)頸內(nèi)動脈和前腦動脈直達底部以阻塞中動脈．假手術(shù)組除了線栓插入深度外其余與模型組一致；大鼠缺血1．5 h拔出線栓以引導血流再灌注．用藥組則將FMN溶解于20 μL DMSO并在1 mL花生油中稀釋．溶劑對照組含有芒柄花素外的其他等量溶劑，即20 μL DMSO于1 mL花生油中稀釋，分別于缺血前15 min腹腔注射入大鼠體內(nèi)質(zhì)量分數(shù)為30 mg／kg．

圖1 實驗方案Fig．1 Experimental protocol

（2）神經(jīng)功能評分 在神經(jīng)功能分別在1．5與24 h進行，標準如下：無神經(jīng)缺血，0分；完全伸展左前肢較困難，1分；不能伸展左前肢，2分；輕微向左轉(zhuǎn)圈，3分；嚴重左轉(zhuǎn)圈，4分；向左傾倒，5分．

（3）BBB通透性檢測 通過伊文思藍滲透實驗檢測BBB通透性［12］．大鼠在處死前30 min按每kg靜脈注射體積分數(shù)為2%伊文思藍2 mL，然后心臟灌注生理鹽水直到流出液無顏色為止．分離缺血側(cè)半球與二甲酰胺在60℃水浴箱中孵育24 h．用分光光度計檢測上清以檢測伊文思藍的濃度從而計算BBB漏出情況．

（4）原位明膠酶譜 MMP-2和MMP-9的活性可以通過在腦組織冰凍切片上利用EnzCheck膠原酶試劑盒原位檢測．前囟后0～2 mm取材切片，行原位明膠酶譜實驗．冠狀冰凍切片與含有質(zhì)量濃度為40 μg／mL FITC-標記的DQ明膠的反應緩沖液37℃孵育2 h，明膠酶酶切DQ-gelatin而產(chǎn)生的肽具有自發(fā)熒光，其熒光強度即明膠酶的活性，用熒光顯微鏡（Zeiss，Germany）來檢測所產(chǎn)生的熒光信號．

（5）免疫印跡（Western blotting）與定量 前囟后2～4 mm取材提取蛋白和mRNA，選取的位置包括整個缺血區(qū)、半暗帶區(qū)和正常組織區(qū)，行免疫印跡和熒光定量PCR實驗．腦組織蛋白經(jīng)RIPA提取后定量，并在體積分數(shù)為10%SDS-PAGE中分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF、封閉后，與抗MMP-9（1∶500）或者β-actin（1∶5 000）的一抗孵育過夜．洗膜、二抗孵育（羊抗鼠，1∶2 000）、再次洗膜，然后用ECL顯影液顯影．所獲取條帶采用ImageJ軟件定量．

（6）熒光定量PCR（Q-PCR） 獲取腦組織后用TRIzol提取總RNA，定量、反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA．以cDNA為模板，加入IL-1β、TNF-α、iNOS和β-actin的引物、熒光染料等在ABI7500中進行PCR反應以對炎癥因子mRNA進行定量．

（7）統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，統(tǒng)計分析在SPSS 18．0統(tǒng)計軟件中進行，P＜0．05具有統(tǒng)計學差異．散點圖和柱狀圖分別由GraphPad Prism 5、OriginPro 8．5制作．

2 結(jié)果

2．1 FMN降低腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評分和BBB通透性

為了檢測FMN的保護作用，首先檢測了缺血再灌大鼠在給藥情況下的神經(jīng)功能改善情況．排除個體差異與實驗誤差，同時在缺血1．5與24 h兩個時間點檢測．假手術(shù)組（Sham）沒有任何神經(jīng)功能缺陷（圖2A）；在缺血1．5 h后，F(xiàn)MN給藥組和溶劑對照組（Vehicle）之間神經(jīng)功能無顯著差異（P＞0．05）；在缺血／再灌后24 h后，F(xiàn)MN給藥組的神經(jīng)功能評分低于溶劑對照組（P＜0．05），提示FMN具有顯著的神經(jīng)保護作用．

為了檢測FMN對BBB通透性影響，用伊文思藍滲透實驗檢測FMN給藥情況下的BBB通透性．Sham組無伊文思藍的滲漏（圖2B），而缺血／再灌可以引起約質(zhì)量分數(shù)為10 μg／g的漏出；相比之下，F(xiàn)MN給藥質(zhì)量濃度降低至4～8 μg／g范圍內(nèi)，與溶劑對照組比較具有顯著差異（P＜0．01）．

2．2 FMN降低MMPs的表達活性

MMPs的激活是引起緊密連接和BBB破壞的主要蛋白酶［13］．為了探討FMN保護BBB的分子機制，用原位明膠酶譜檢測MMPs的活性以及Western blotting檢測腦內(nèi)MMP-9的表達．FMN顯著地降低了MMPs激活所引起的酶切底物熒光強度（圖3A），F(xiàn)MN可降低MMP-9的表達（圖3B、C，P＜0．05），提示FMN給藥可顯著地抑制缺血再灌大鼠腦內(nèi)的MMPs的活性與表達水平．

2．3 FMN降低炎癥因子的mRNA表達

缺血再灌注過程中的炎癥因子大量表達與釋放是引起B(yǎng)BB破壞與MMPs激活的關(guān)鍵因素．用定量PCR技術(shù)檢測腦內(nèi)的炎癥因子的表達水平，腦缺血與再灌損傷可明顯增加iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA的表達，而FMN顯著地降低缺血再灌大鼠腦內(nèi)iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA水平（圖4，P＜0．01）．

圖2 FMN對腦缺血再灌大鼠神經(jīng)功能評分和伊文思藍滲漏的影響Fig．2 The effects of FMN on the neurology score and Evans blue leakage in brain ischemia-reperfused rats

圖3 FMN對腦缺血再灌大鼠MMPs的活性和表達的影響Fig．3 The effects of FMN on the MMPs activity and expression in brain ischemia-reperfused rats

圖4 FMN對缺血再灌大鼠腦內(nèi)iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表達的影響Fig．4 The effects of FMN on the mRNA expression of iNOS，IL－1β and TNF－α in brain ischemia-reperfused rats

3 討論

缺血再灌注損傷過程中的神經(jīng)炎癥是引起血腦屏障破壞、腦水腫及神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素，降低炎癥反應的多種措施可以顯著地保護BBB、阻止腦水腫和神經(jīng)損傷．本研究結(jié)果顯示，黃芪的主要成分芒柄花素非常顯著地減少炎癥因子iNOS、IL-1β和TNF-α的表達、降低MMPs活性和BBB通透性、改善神經(jīng)功能損傷，具有明顯的神經(jīng)保護作用．

研究表明黃芪提取物具有良好的神經(jīng)保護作用［14］，黃芪含有上百種活性成分包括皂苷、多糖和異黃酮等［15－16］．而黃芪甲苷IV可以縮小缺血大鼠的梗塞面積和并保護BBB完整性，其作用機制與抗氧化和抗神經(jīng)炎癥有關(guān)［17－20］．毛蕊異黃酮和芒柄花素是黃芪中的異黃酮，二者僅相差一個羥基．毛蕊異黃酮顯著地改善神經(jīng)缺陷并降低梗死面積［21］．已經(jīng)證實FMN對小鼠全腦缺血具有腦保護作用并可降低水腫和腦內(nèi)炎癥［10］．本研究結(jié)果提示，F(xiàn)MN可以清除顯著降低iNOS、IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達并且改善神經(jīng)缺損癥狀，F(xiàn)MN降低BBB通透性和MMPs活性的作用．在腦缺血再灌損傷過程中，BBB破壞可引起毒性物質(zhì)從血液進入腦實質(zhì)，擴大梗死面積；還可介導血管源性的腦水腫［4－6］．因此，保護BBB是阻止腦缺血再灌進一步損傷的關(guān)鍵治療策略．通過伊文思藍滲透實驗，F(xiàn)MN可明顯地降低腦卒中大鼠模型的BBB通透性．BBB開放依賴于MMPs即一組鋅離子依賴的蛋白酶，在腦缺血再灌損傷中其表達和活性顯著增加，降解緊密連接蛋白和環(huán)繞在內(nèi)皮細胞與星形膠質(zhì)細胞足板周邊的基質(zhì)，從而引起B(yǎng)BB開放［22］．本研究中Western blotting和原位明膠酶譜實驗顯示FMN既減少MMP-9的表達又降低MMPs的明膠酶活性，進一步證實FMN對BBB的保護作用．

總之，本研究提示FMN在腦缺血再灌損傷中的腦保護與減弱神經(jīng)炎癥功能，具有保護BBB的作用，為充分理解黃芪的藥理活性與FMN潛在的在腦梗死治療方面的運用提供了實驗依據(jù)．

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［責任編輯：朱穎嫄］

Formononetin protects blood-brain barrier and inhibits neuroinflammation during focal cerebral ischemia and reperfusion

GU Minhua1，HONG Wen1，TANG Chuanqi1，LI Wei2，GU Yong2
（1．Department of Chinese Medicine，Dongsheng Hospital，Guangzhou 510120，China；2．Department of Neurology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Aim：To investigate the effect of formononetin（FMN）on blood-brain barrier（BBB）permeability and neuroinflammation in a rat model of focal brain ischemia-reperfusion．Methods：Middle cerebral artery occlusion was employed to establish a brain ischemia model．Evans blue leakage assay was used to determine the BBB permeability．MMPs activity in brain sections was observed by in situ zymography．The expression of inflammatory factors was determined by fluorescent quantitative PCR．Results：FMN significantly ameliorated neurological deficits and reduced BBB permeability in the model of brain ischemia-reperfusion．Furthermore，F(xiàn)MN remarkably reduced MMP-9 expression，MMPs activity in the ischemic brain and decreased the mRNA expression of inflammatory factors，including inducible nitric oxide synthase，tumor necrotic factor-α and interleukin-1β．Conclusion：These results，when taken together，suggest that FMN has the effect of protecting BBB and inhibiting neuroinflammation during ischemiaand reperfusion．

formononetin；Astragali Radix；blood-brain barrier；neuroinflammation；cerebral ischemia and reperfusion

R743．3

A

1000－9965（2015）01－0034－06

10．11778／j．jdxb．2015．01．006

2014－06－19

國家自然科學基金青年項目（81400990）；湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心創(chuàng)新團隊項目子課題（2011JH－2013CXTT08）；南方醫(yī)科大學“科研啟動計劃”青年科技培育項目（B1012158）

顧民華（1980－），女，研究方向：中醫(yī)藥腦保護

顧 勇，男，副研究員，醫(yī)學博士；Tel：020－61641964；E-mail：yonggu＠smu．edu．cn