輔助生殖技術(shù)中鋅對精子的保護(hù)作用

王正堯，吳金香，尤柳霞，蔡俊峰

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，福建泉州362000）

輔助生殖技術(shù)中鋅對精子的保護(hù)作用

王正堯，吳金香，尤柳霞，蔡俊峰

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，福建泉州362000）

目的：探討輔助生殖技術(shù)中鋅保護(hù)精子損傷的作用．方法：應(yīng)用精子密度梯度離心的方法進(jìn)行精子優(yōu)選，優(yōu)選的精子分為空白對照組、過氧化氫處理組和實驗組，實驗組受過氧化氫刺激同時加入鋅，培養(yǎng)5h后比較3組精子的存活率、活力、精子質(zhì)膜完整性及精子DNA碎片．結(jié)果：過氧化氫刺激后精子的存活率、活力差，精子質(zhì)膜完整性破壞，大量精子DNA損傷，而鋅能明顯保護(hù)精子質(zhì)量的作用．結(jié)論：在輔助生殖技術(shù)中鋅可抑制精子損傷，從而提高精子質(zhì)量的作用．

精子；活性氧；輔助生育技術(shù)；精子質(zhì)量

輔助生育技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）中精子體外優(yōu)選處理、冷凍及復(fù)蘇過程中導(dǎo)致的精子損傷影響著精液常規(guī)的各項指標(biāo)［1］．目前國內(nèi)外ART成功率僅50%左右，提高精子質(zhì)量與胚胎質(zhì)量，可提高ART中妊娠的成功率．鋅是男性體內(nèi)精子生長發(fā)育過程中不可缺少的微量元素．大量研究表明，體內(nèi)鋅具有保護(hù)精子的作用［2－4］．本研究在優(yōu)選后的精子中加入適量的鋅，通過比較精子的存活率、活力以及精子低滲腫脹實驗和精子DNA碎片檢測判斷鋅能否抑制精子的損傷作用，旨在判斷ART中鋅能否改善精子質(zhì)量作用．

1 材料和方法

1．1 材料

10例正常健康男性精液樣品，取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院有生育能力的青年自愿者，年齡25～30歲，平均（26±2）歲．ZnCl2為瑞士Adamasbeta公司產(chǎn)品；體積分?jǐn)?shù)為30%H2O2由西隴化工股份有限公司提供；體積分?jǐn)?shù)為40%上層梯度離心液、體積分?jǐn)?shù)為80%下層梯度離心液及洗精液均購自美國Quinn's公司；精子DNA碎片檢測試劑盒購于深圳博銳德生物科技有限公司；精子質(zhì)量分析系統(tǒng)為北京國聯(lián)醫(yī)療技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Olympus CX31型光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn)．

1．2 方法

（1）精子活力與存活率的分析 10份精液標(biāo)本，置37℃水浴箱待液化，分別用體積分?jǐn)?shù)為40%和80%高密度離心液制備梯度液300 g 15 min獲取優(yōu)質(zhì)精子，Quinn’s洗精液300 g 5min洗滌優(yōu)質(zhì)精子2次后將精子密度調(diào)至5．0×109～1．0×1010／L，每份0．3 mL平均分為3組：ZnCl2＋H2O2組含質(zhì)量濃度為1．7 μg／mL ZnCl2及體積分?jǐn)?shù)為0．001%的H2O2；H2O2組含體積分?jǐn)?shù)為0．001%H2O2；空白組加入等量體積分?jǐn)?shù)為0．9%NaCl2．3組同時置37℃體積分?jǐn)?shù)為5%C02孵箱中孵育5 h后，用國聯(lián)精子檢測系統(tǒng)觀察精子運動功能的變化．

（2）精子質(zhì)膜完整性的判斷 應(yīng)用低滲膨脹實驗來評估精子質(zhì)膜的完整性：3組同時置37℃體積分?jǐn)?shù)為5%C02孵箱中孵育5 h后，分別取100 μL樣品置100 μL無菌蒸餾水中靜置5 min后，各取10 μL于潔凈載玻片，并覆蓋上蓋玻片，400倍鏡下隨機(jī)選取視野觀察，計數(shù)200個精子，按以下公式計算出質(zhì)膜完整精子百分率：

（3）精子DNA碎片的檢測 本實驗采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法進(jìn)行檢測：3組同時置37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵箱中孵育5 h后，分別取60 μL，參照精子DNA檢測說明進(jìn)行操作．DNA完整的精子在經(jīng)過變性和去掉核蛋白后DNA擴(kuò)散形成特征性的光暈，而存在DNA碎片的精子不會產(chǎn)生特征性的光暈．根據(jù)光暈的有無和大小判斷精子DNA的完整程度．精子DNA碎片判斷標(biāo)準(zhǔn)：精子頭部僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈，單側(cè)光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1／3（圖1）．400倍鏡下隨機(jī)選取視野觀察，計數(shù)500個精子，按以下公式計算出存在DNA碎片精子百分率：

圖1 精子DNA碎片檢測示意圖Fig．1 Sperm DNA fragmentation detection schematic diagram

1．3 應(yīng)用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組的均數(shù)比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，雙側(cè)檢驗，P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)差異．

2 結(jié)果

2．1 鋅保護(hù)優(yōu)選后精子活力與活率作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后在H2O2作用下精子運動能力顯著下降，明顯低于同時加入適量ZnCl2的實驗組（表1）．

表1 鋅保護(hù)優(yōu)選后精子活力與存活率作用（±s）Table 1 The function of zinc in protecting selected sperm motility and viability（±s）

表1 鋅保護(hù)優(yōu)選后精子活力與存活率作用（±s）Table 1 The function of zinc in protecting selected sperm motility and viability（±s）

1）與對照組相比較，P＜0．001；2）與對照組相比較，P＜0．001；1）與2）相比較，P＜0．001．

組別n／例精子活力（a＋b）／%精子存活率／%對照組1077．77±4．8992．50±2．13 ZnCl2＋H2O21026．14±2．561）51．47±5．08 H2O2103．43±1．062）20．51±3．76

2．2 鋅抑制優(yōu)選后精子質(zhì)膜的損傷作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后H2O2具損傷精子質(zhì)膜的作用，且損傷程度明顯高于同時加入適量ZnCl2的實驗組（圖2、表2）．

2．3 鋅對優(yōu)選后精子DNA的保護(hù)作用

10例正常健康男性精液經(jīng)ART中精液優(yōu)化處理后在H2O2刺激下精子DNA完整性嚴(yán)重破壞，DNA損傷程度明顯高于同時加入適量ZnCl2的實驗組（圖3、表3）．

圖2 精子質(zhì)膜完整性Fig．2 sperm plasma membrane integrity

圖3 精子DNA完整性Fig．3 Sperm DNA integrity

表2 鋅抑制優(yōu)選后精子質(zhì)膜的損傷作用（χ—±s）Table 2 Zinc inhibited the injury of selected sperm plasma membrane(±s）

表2 鋅抑制優(yōu)選后精子質(zhì)膜的損傷作用（χ—±s）Table 2 Zinc inhibited the injury of selected sperm plasma membrane(±s）

1）與對照組相比較，P＜0．001；2）與對照組相比較，P＜0．001；1）與2）相比較，P＜0．001．

組別n／例精子質(zhì)膜完整率／%對照組1093．90±1．67 ZnCl2＋H2O21058．90±3．411）H2O21025．50±4．772）

表3 鋅對優(yōu)選后精子DNA的保護(hù)作用（±s）Table 3 Zinc protected DNA of selected sperm（±s）

表3 鋅對優(yōu)選后精子DNA的保護(hù)作用（±s）Table 3 Zinc protected DNA of selected sperm（±s）

1）與對照組相比較，P＜0．001；2）與對照組相比較，P＜0．001；1）與2）相比較，P＜0．001．

組別n／例精子DNA完整率／%對照組1098．79±0．42 ZnCl2＋H2O21055．07±2．951）H2O21019．28±1．342）

3 討論

近年國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)精子結(jié)構(gòu)和功能改變，造成精子的質(zhì)量降低［5－7］．當(dāng)男性生殖系統(tǒng)發(fā)生缺氧、炎癥以及ART前期對精子的離心、冷凍及復(fù)蘇等會產(chǎn)生高水平的過氧化物，超過了精子自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力，從而導(dǎo)致精子質(zhì)膜的過氧化和DNA損傷．Villani等［7］應(yīng)用過氧化氫和脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）對人、老鼠和公牛3個物種的精子進(jìn)行處理研究，結(jié)果表明3物種精子DNA碎片損傷與過氧化氫和DNase酶密切相關(guān)，而人的精子對DNase酶的敏感性最高．男性精子DNA碎片化造成精子內(nèi)部遺傳信息的不完整，嚴(yán)重影響生育情況，會導(dǎo)致不孕，反復(fù)流產(chǎn)，胎兒畸形，胎兒發(fā)育停滯，輔助生殖失敗等．目前國內(nèi)外大量的研究表明：精子DNA碎片化形成可能與炎癥、凋亡、氧化損傷以及環(huán)境因素等多種因素作用相關(guān)［8－10］．

鋅是人體重要的必須微量元素，在男性前列腺、睪丸及精漿中含量較高，對男性生殖具有重要作用．鋅作為體內(nèi)200多種酶的輔助因子，與生殖系統(tǒng)的代謝密切相關(guān)，精漿中適量的鋅能夠促進(jìn)精子核成熟，提高精子質(zhì)量，其含量降低將影響精子的發(fā)生、發(fā)育、成熟和受精過程，使精液密度和存活率下降，降低精子質(zhì)量，從而使受精能力降低［11］；鋅具有抗氧化能力，可延緩細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，以維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和生理通透性，其缺乏可導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力降低，影響精子運動，使精子DNA損傷［12］；Juriy等［13］研究Ca2＋與Mg2＋依賴的DNase在中間球海膽（sea urchin strongylocentrotus intermedius）精子中的活化并激活半胱天冬酶（caspases）系統(tǒng)降解精子DNA的機(jī)制，指出鋅可以阻斷DNase降解中間球海膽精子DNA的作用，從而減少中間球海膽精子DNA碎片的作用．鋅還具有免疫抗炎作用，是前列腺中重要的抗感染因子；精漿中適量的鋅對男性生育的診斷及治療有一定指導(dǎo)作用．

已經(jīng)發(fā)展30多年的ART，可促進(jìn)精液液化，通過各種方法去除精液中的白細(xì)胞、死精子以及部分畸形精子等，達(dá)到精子優(yōu)選的目的，但無法去除DNA損傷的精子．目前在ART中人們通常使用的精子培養(yǎng)基是模擬輸卵管液，尚未知在培養(yǎng)基中加入適量的鋅對精子是否對外界損傷的保護(hù)作用．本研究主要采用ART中優(yōu)選的精子為實驗對象，以過氧化氫為損傷刺激物，通過適量的ZnCl2進(jìn)行干預(yù)，在國聯(lián)精子軟件分析、低滲腫脹實驗以及精子DNA碎片檢測來判斷鋅能否抑制過氧化氫對精子的損傷刺激作用，從而提高精子質(zhì)量的目的．本實驗結(jié)果顯示，在ART中適量的鋅能抑制過氧化氫對精子的損傷作用，不僅提高精子的存活率及活動力，還能保護(hù)精子質(zhì)膜與精子DNA完整性作用，從而提高精子質(zhì)量．在本研究中體外培養(yǎng)基中Zn2＋質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于精漿中的Zn2＋質(zhì)量濃度，主要是Zn2＋在體內(nèi)不同部位的質(zhì)量濃度分布不一，ART中應(yīng)用的培養(yǎng)基主要是參照輸卵管液，可見在輸卵管位置Zn2＋的質(zhì)量濃度明顯少于精漿．本實驗組將進(jìn)一步研究鋅是否通過質(zhì)膜離子通道維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生理通透性，還是通過抑制caspases系統(tǒng)阻斷DNase降解精子DNA從而保護(hù)精子質(zhì)量的作用．鋅能抑制過氧化氫損傷精子質(zhì)量的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究．

［1］FATMA B A，NOZHA C F，INES D，et al．Sperm quality improvement after date seed oil in vitro supplementation in spontaneous and induced oxidative stress［J］．Asian Journal of Andrology，2009，11（3）：393－398．

［2］EBISCH I M，THOMAS C M，PETERS W H，et al．The importance of folate，zinc and antioxidants in the pathogenesis and prevention of subfertility［J］．Hum Reprod Update，2007，13（2）：163－174．

［3］SANKAKO1 M K，GARCIA P C，PIFFER R C，et al．Possible mechanism by which zinc protects the testicular function of rats exposed to cigarette smoke［J］．Pharmacological Reports，2012，64（6）：1537－1546．

［4］KOTDAWALA A P，KUMAR S，SALIAN S R，et al．Addition of zinc to human ejaculate prior to cryopreservation prevents freeze-thaw-induced DNA damage and preserves sperm function［J］．J Assist Reprod Genet，2012，29（12）：1447－1453．

［5］NOVOTNY J，AZIZ N，RYBAR R，et al．Relationship between reactive oxygen species production in human semen and sperm DNA damage assessed by Sperm Chromatin Structure Assay［J］．Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2013，157（4）：383－386．

［6］MOUSTAFA M H，SHARMA R K，THOMTON J，et al．Relationship between ROS production，apoptosis and DNA denaturation in spermatozoa from patients examined for infertility［J］．Human Reproduction，2004，19（1）129－138．

［7］VILLANI P，ELEUTERI P，GROLLINO M G，et al．Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide：an in vitro comparative study among different mammalian species［J］．Reproduction，2010，140（3）：445－452．

［8］DUPONT C，F(xiàn)AURE C，SERMONDADE N，et al．Obesity leads to higher risk of sperm DNA damage in infertile patients［J］．Asian J Androl，2013，15（5）：622－625．

［9］LO′PEZ G，LAFUENTE R，CHECA M A，et al．Diagnostic value of sperm DNA fragmentation and sperm highmagnification for predicting outcome of assisted reproduction treatment［J］．Asian Journal of Andrology，2013，15（6）：790－794．

［10］ZHANG H B，LU S M，MA C Y，et al．Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation［J］．Asian J Androl，2008，10（2）：227－235．

［11］OMU A E，AL-QATTAN F，AI-ABDUL-HADI F M，et al．Seminal immune response in infertile men with leukocytospermia：effect on antioxodant activity［J］．Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，1999，86（2）：195－202．

［12］OMU A E，AL-AZEMI MK，KEHINDE E O，et al．Indications of the mechanisms involved in improved sperm parameters by zinc therapy［J］．Med Princ Pract，2008，17（2）：108－116．

［13］JURIY T，SIBIRTSEV，VALERIA V，et al．Ca2＋，Mg2＋－dependent DNase Involvement in apoptotic effects in spermatozoa of sea urchin strongylocentrotus intermedius induced by two-headed sphingolipid rhizochalin［J］．Mar Biotechnol，2011，13（3）：536－543．

［責(zé)任編輯：朱穎嫄］

Zinc protects sperm quality in assisted reproductive technology

WANG Zhengyao，WU Jinxiang，YOU Liuxia，CAI Junfeng
（Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

Aim：To study the action of zinc that reduces sperm damage in assisted reproductive technology．Methods：The preferred sperms selected by density gradient centrifugation were divided into blank control group，hydrogen peroxide-treated group，and experimental group which was treated with both hydrogen peroxide and Zinc；The three groups were compared in sperm motility，viability，sperm plasma membrane integrity，and sperm DNA fragmentation after 5h incubation．Results：The sperm motility and vitality decreased，the membrane integrity was destroyed，and the sperm DNA was damaged after the sperms were incubated with hydrogen peroxide．However，Zinc could protect the sperms from the damage significantly．Conclusion：Zinc reduces sperm damage in the assisted reproductive technology，and thereby improves the quality of sperm．

Sperm；reactive oxygen species；assisted reproductive technology；sperm quality

R321

A

1000－9965（2015）01－0029－05

10．11778／j．jdxb．2015．01．005

2014－06－17

福建省衛(wèi)生廳青年科研基金項目（2011－1－36）

王正堯（1977－），男，主管檢驗師，研究方向：不孕不育檢測及輔助生殖技術(shù)．Tel：0595－22768100，E－mail：wzy19770127＠163．com