基于生物質甘蔗渣的熒光碳量子點制備

陳文新，陽運華，劉應亮，曹喜民

（1．暨南大學生命科學技術學院化學系，廣東廣州510632；2．廣東省微生物研究所，廣東廣州510070；3．華南農業(yè)大學理學院，廣東廣州510642；4．廣東省清遠市美樂仕油墨有限公司，廣東清遠511500）

基于生物質甘蔗渣的熒光碳量子點制備

陳文新1，陽運華2，劉應亮3，曹喜民4

（1．暨南大學生命科學技術學院化學系，廣東廣州510632；2．廣東省微生物研究所，廣東廣州510070；3．華南農業(yè)大學理學院，廣東廣州510642；4．廣東省清遠市美樂仕油墨有限公司，廣東清遠511500）

本實驗以富含纖維素的廢棄生物質甘蔗渣為原料，采用水熱法合成了具有熒光性能的碳量子點．對碳量子點進行了表征，其粒徑大小約為5～10 nm；在紫外燈照射下發(fā)藍色熒光，對其熒光性能進行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有多元激發(fā)、多元發(fā)射的性質．對其細胞毒性進行了研究，結果表明是一種生物相容性良好的標記材料．

熒光碳量子點；甘蔗渣；水熱碳化；細胞標記

近年來，熒光碳納米材料因其具有良好的光學特性和細胞低毒性引起了科研工作者們的廣泛研究．它具有較好的光穩(wěn)定性，且無毒副離子的存在，適用于長時間的檢測和示蹤的實驗，在生物標記［1］和分析檢測［2］等方面具有廣闊的應用前景．如Sun等［3］采用PPEI－EI鈍化后的碳量子點用于人體乳腺癌MCF－7細胞的標記；Li等［4］利用碳量子點實現(xiàn)了對DNA的檢測；Goncalves等［5］將碳量子點用作生物納米傳感器，用于檢測環(huán)境中重金屬汞離子的存在，這種探針具有可逆性、反應時間短和穩(wěn)定的優(yōu)點，豐富了碳量子點的應用范圍．

目前人們已通過不同的原料成功地制備出了熒光碳納米材料［6］，主要是各種有機小分子物質如采用葡萄糖［7］、蔗糖［8］、果糖、檸檬酸［9］等；也有采用石墨［10］、多壁碳納米管［11］、蠟燭灰［12］等為原料制備碳量子點．隨著人們對環(huán)境的重視，廢棄生物質的利用越來越引起大家的關注，已有不少研究者采用以廢棄生物質為原料制備熒光碳納米材料．如：Sarkar等［13］通過收集烘烤花生所產(chǎn)生的花生衣在氮氣700℃下制備了熒光碳質納米球．Chang等［14］將藍山咖啡渣為原料獲得了含sp2碳的量子點，Han等［15］將西瓜皮在220℃碳化2h，獲得了2nm左右的碳納米粒子．Krysmann等［16］以生物質草為原料，通過熱解的方法獲得了具有熒光性能的碳量子點．Sun等［17］過水熱處理柚子皮來制備熒光碳納米粒子，而我們課題組也以生物質殼聚糖為原料，制備了氨基功能化的熒光碳納米粒子［18］．

甘蔗渣是指甘蔗經(jīng)過榨糖之后剩下的部分，它來源集中、產(chǎn)量大，是一種重要的可再生生物資源．它的成分以纖維素，半纖維素以及木質素為主，木質化程度高，蛋白、淀粉和可溶性糖含量較少．以甘蔗渣作為制備碳材料的來源也有報道，如Nieto－Delgado［19］和Purnomo等［20］采用甘蔗渣作為原料制備活性炭，Zhuo等［21］以甘蔗渣制備活性炭并將其應用于超級電容器．

在本研究中，選用富含纖維素的廢棄生物質甘蔗渣作為碳源，采用綠色環(huán)保的水熱碳化技術，制備具有熒光性能的碳量子點，為廢棄生物質材料的利用開辟了一個新的途徑．

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

甘蔗進行壓榨，多次水洗過濾除去剩余糖分，并烘干備用；實驗所用水為超純水．

1．2 熒光碳量子點的合成和表征

將1．0 g甘蔗渣粉末（已干燥碾碎）分散于30 mL蒸餾水中，然后倒入50 mL的聚四氟乙烯內襯不銹鋼反應釜里，密封后將反應釜置于180℃下恒溫反應12 h，然后自然冷卻至室溫，打開反應釜，將所得的產(chǎn)物超聲分散，然后離心分離，除去沉淀，對所獲得的上層液進行透析，最后將產(chǎn)品冷凍干燥24 h，獲得產(chǎn)物在紫外燈照射下發(fā)藍色熒光的碳量子點（carbon dots，CDs）．

采用JEOL JEM－2010HR型高分辨透射電子顯微鏡對樣品形貌進行表征；原子力顯微鏡（AFM）在SPM Dimesion 3100型原子力顯微（Veeco，美國）鏡上采用Tapping模式進行；傅立葉紅外光譜（FTIR）用德國Bruker EQUINOX 55型傅立葉紅外吸收光譜儀上測定；紫外吸收光譜采用Cary 5000（Varian）光譜儀進行測定；采用熒光光譜儀（F－4500，150 W Xe燈，日立公司）對其熒光性能進行測試．

1．3 細胞標記

所使用的細胞為人肺腺癌細胞株A549細胞，暨南大學醫(yī)學院提供．DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清等，Gibcobrl公司，美國．實驗中需要用的EP管、一次性槍頭及一次性塑料離心管都采用高壓滅菌，培養(yǎng)皿采用紫外線照射殺菌．

將培養(yǎng)好的人體肺腺癌上皮細胞A549接種到激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，鋪滿培養(yǎng)皿后為其更換新的培養(yǎng)基，再加入質量濃度為100 μg／mL的熒光碳量子點共孵育6 h．倒掉培養(yǎng)基，將細胞用PBS沖洗3次，加入戊二醛固定液使細胞固定15 min．于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞的成像情況，選擇激發(fā)波長為405 nm并進行熒光拍照．

1．4 體外細胞毒性試驗

采用MTT法檢測細胞毒性，MTT溶液采取現(xiàn)用現(xiàn)配，避光操作，稱取20 mg MTT固體粉末，加入4 mL的PBS（磷酸鹽緩沖液pH 7．4）溶液，充分混勻后避光使用．

將人體肺腺癌上皮細胞A549培養(yǎng)在加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)．取對數(shù)生長期的A549細胞，細胞量為5×104／孔，接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔各加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，加入不同質量濃度的熒光碳量子點（25、50、100、200 μg·mL－1），對照組細胞為不加任何材料的DMEM培養(yǎng)基，每個質量濃度組加9個孔．96孔板置于37℃培養(yǎng)箱下分別培養(yǎng)24、48、72 h，洗細胞3次后進行毒性試驗．每孔加入20 μL質量濃度為5 mg／mL的MTT溶液，繼續(xù)反應4 h，棄去含材料的培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，于各孔中加入助溶劑酸化異丙醇，混勻至活細胞與MTT形成的紫色結晶完全溶解后，置于酶標儀上，490 nm下讀取A值，比較毒性影響．

以A490作為細胞增殖的指標，數(shù)值為3次實驗的平均值，每次實驗每個樣本在每個質量濃度和每個實驗時間點都設置9個復孔．細胞相對活性計算公式如下：

細胞相對活性（%）＝（A490樣本－A490空白）／（A490對照－A490空白）×100

其中A490樣本為所測樣本的吸收值，A490對照為沒經(jīng)處理的僅有活細胞的對照孔的對照值，A490空白為空白孔的吸收值；Control組采用的對照是0 h的，認為其是100%的細胞存活率，使用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以均值標準差表示．

2 結果與討論

2．1 透射電鏡分析

從普通透射電鏡（圖1a）中可以得出，所制備的碳量子點有一個較為廣泛的粒徑分布，由幾個納米至十幾個納米不等．從高分辨透射電鏡（圖1b）可以看出，以甘蔗渣為原料制備的碳量子點粒徑大小均勻，大約為5～10 nm，且具有晶格條紋，其晶間距為0．32 nm．

（a）碳量子點的透射電鏡圖；（b）高分辨透射電鏡圖圖1 碳量子點的透射電鏡圖（a）TEM image of the CQDs；（b）HRTEM image of the CQDsFig．1 TEM image of CQDs

2．2 原子力顯微鏡分析

圖2是所制備的碳量子點的原子力顯微鏡圖片，從圖中可以得出其粒徑約為2～20 nm，具有較寬的粒徑分布．

（a）碳量子點于云母片上的原子力顯微鏡圖；（b）圖a中劃線部分的高度圖；（c）碳量子點的三維圖譜圖2 碳量子點的原子力顯微鏡分析（a）AFM image of the CQDs deposited on freshly cleaved mica substrates；（b）The height profile along the line in（a）；（c）The 3－d image of the CQDs．Fig．2 AFM image of CQDs

2．3 紅外光譜分析

從碳量子點的紅外光譜圖（圖3）可以看出，3 433 cm－1吸收峰對應O－H氫鍵的伸縮振動，1 700 cm－1和1 623 cm－1吸收峰分別屬于和伸縮振動峰；在1 000～1 500 cm－1內的吸收峰對應C—O鍵的伸縮振動和O—H鍵彎曲振動吸收，表明樣品表面有一定的羥基、羧基等官能團．

圖3 碳量子點的紅外光譜圖Fig．3 FTIR spectra of the CQDs

2．4 紫外和熒光光譜分析

圖4a給出了甘蔗渣水熱碳化樣品的紫外吸收光譜圖，從圖中可以看出，碳量子點在紫外吸收區(qū)域沒有一個很明顯的吸收峰，但是有一個寬的吸收波譜，這很可能是由于量子點的一個比較寬的粒徑分布．制得的碳量子點在水溶液中具有較好的分散性，能保持半年以上無沉淀產(chǎn)生．同時，在365 nm的紫外燈照射下，溶解于水的量子點溶液發(fā)出強的藍光（如圖4a中插圖所示）．為進一步研究所得到的碳量子點的光學性質，圖4b是采用F4500熒光分光光度計在不同的激發(fā)波長激發(fā)碳量子點后得到一系列光致發(fā)光光譜．從圖中可以看出，碳量子點與其他大部分發(fā)光碳納米粒子的熒光光譜圖一樣，都依賴于激發(fā)波長，呈現(xiàn)出多元激發(fā)、多元發(fā)射的熒光光譜特性．當激發(fā)波長向長波方向移動時，熒光發(fā)射峰也隨之紅移．當激發(fā)波長從300～480 nm變化時，其最大發(fā)射峰位置和強度也隨之變化，發(fā)光強度是先增加后降低；其中360 nm左右達到最佳激發(fā)波長．從以360 nm的波長作為激發(fā)波長獲得的熒光發(fā)射譜圖可以看出，最強的發(fā)射峰出現(xiàn)在450 nm左右，整個發(fā)射峰覆蓋在420～550 nm之間，屬于藍光范圍，這與波長為365 nm的紫外燈照射下觀察到的藍光發(fā)射是一致的．

（a）碳量子點的紫外圖譜（插圖為碳量子點溶液于365 nm紫外燈照射下圖片）；（b）碳量子點在不同激發(fā)波長（300～480 nm）下的發(fā)射光譜圖4 碳量子點的吸收光譜和發(fā)射光譜（a）Absorption spectra of the CQDs（inset：photograph of the samples excited by a 365 UV lamp）；（b）Emission spectra of the CQDs at different excited（300～480 nm）Fig．4 Absorption spectra and emission spectra of the CQDs

同時，對所獲得的碳量子點進行了熒光量子產(chǎn)率的測定，測得其熒光量子效率約為1．65%．

我們認為熒光碳量子點的形成是由于甘蔗渣中的主要成分如纖維素、木質素、可能的剩余糖分等碳水化合物在水熱條件下進行碳化，形成了具有熒光性能的碳量子點．

2．5 細胞標記與體外細胞毒性

將碳量子點用220 nm的過濾膜過濾，然后取10 μL加入到含有90 μL的1%BSA的PBS－Mg（PBS＋5 mM MgCl2）EP中，用移液槍吹打混合均勻．先采用PBS溶液對細胞進行沖洗3次，洗掉培養(yǎng)液，然后加入配好的碳量子點與PBS緩沖液的混合物，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后用PBS緩沖液清洗3遍以上，洗掉未標記上的熒光碳量子點溶液，采用戊二醇固定，于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察．

（a）543 nm激發(fā)，633 nm發(fā)射；（b）無熒光；（c）圖（a）和（b）的疊加圖5 碳量子點標記A549細胞的激光共聚焦顯微鏡圖（a）ex：543 nm，em：633 nm；（b）A brightfield；（c）An overlay image of（a）and（b）．Fig．5 A confocal fluorescence microphotograph of A549 cells labeled with the carbon quantum dots

激光共聚焦的設置參數(shù)為：采用543 nm激發(fā)、633 nm發(fā)射波長下觀測其紅色熒光，采集圖片，所獲得的細胞標記圖片如圖5所示．從圖中可以看出，碳量子點能很好地進行細胞標記，且在543 nm的波長激發(fā)下，能發(fā)紅色熒光．

圖6 碳量子點在不同質量濃度以及不同培養(yǎng)時間的細胞毒性Fig．6 Cytotoxicity evaluations test of A549 cells with different concentrations of carbon quantum dots after 48 h and 72 h incubation

同時，對碳量子點的細胞毒性也進行了測試，結果表明（圖6），與細胞培育72 h時未發(fā)現(xiàn)碳量子點對細胞產(chǎn)生明顯的毒性，當質量濃度為200 μg／mL，孵育時間為72 h時，細胞的活性仍超過了85%，結果表明我們所合成的碳量子點與其他碳量子點一樣，具有較低的細胞毒性，在生物標記中具有較好的應用前景．

3 結論

采用生物質廢棄物甘蔗渣作為碳源，利用水熱法制得了良好分散性的碳量子點，對其熒光性能進行了分析，發(fā)現(xiàn)具有一定的熒光性能，發(fā)射波長依賴于激發(fā)波長，呈現(xiàn)出多元激發(fā)、多元發(fā)射的熒光光譜特性，測得其熒光量子效率為1．65%．采用A549細胞進行熒光標記，結果顯示所制得的碳量子點具有良好的熒光標記性能，在200 μg／mL的質量濃度下培養(yǎng)72 h后細胞的成活率仍然在85%以上，生物相容性較好．這種制備方法為我們進一步采用其他生物質原料為碳源，制備具有熒光性能的碳納米材料提供了實驗方法．

特別鳴謝：感謝清遠市美樂仕油墨有限公司資助項目對本論文的幫助．

［1］LI H T，LIU Y，YU H，et al．Synthesis of fluorescent carbon nanoparticles directly from active carbon via a one-step ultrasonic treatment［J］．Materials Research Bulletin，2011，46（1）：147－151．

［2］HUANG H Q，ZENG P，HAN B F，et al．Preparation of fluorescent carbon dots and its cytotoxicity for saccharomyce cerevisiae［J］．Chinese Journal of Inorganic Chemistry，2012，28（1）：13－19．

［3］SUN Y P，ZHOU B，LIN Y，et al．Quantum-sized carbon dots for bright and colorful photoluminescence［J］．Journal of the American Chemical Society，2006，128（24）：7756－7757．

［4］LI H L，ZHANG Y，WANG L，et al．Nucleic acid detection using carbon nanoparticles as a fluorescent sensing platform［J］．Chemical Communications，2011，47（3）：961－963．

［5］GONCALVES H，JORGE P，F(xiàn)ERNANDES J，et al．Hg（II）sensing based on functionalized carbon dots obtained by direct laser ablation［J］．Sensors and Actuators BChemical，2010，145（2）：702－707．

［6］LIU Y L，XIE C L．Recent progress in the synthesis of porous carbon materials［J］．Journal of Jinan University，2011，32（3）：339－344．

［7］HUI P，JADRANKA T S．Simple aqueous solution route to luminescent carbogenic dots from carbohydrates［J］．Chemistry of Materials，2009，21（23）：5563－5565．

［8］ZHANG J C，SHEN W Q，PAN D Y，et al．Controlled synthesis of green and blue luminescent carbon nanoparticles with high yields by the carbonization of sucrose［J］．New Journal of Chemistry，2010，34（4）：591－593．

［9］BOURLINOS A B，STASSINOPOULOS A，ANGLOS D，et al．Photoluminescent carbogenic dots［J］．Chemistry of Materials，2008，20（14）：4539－4541．

［10］Hu S L，NIU K Y，SUN J，et al．One-step synthesis of fluorescent carbon nanoparticles by laser irradiation［J］．Journal of Materials Chemistry，2009，19（4）：484－488．

［11］ZHOU J，BOOKER C，LI R，et al．An electrochemical avenue to blue luminescent nanocrystals from multiwalled carbon nanotubes（MWCNTs）［J］．Journal of the American Chemical Society，2007，129（4）：744－745．

［12］LIU H P，YE T，MAO C D．Fluorescent carbon nanoparticles derived from candle soot［J］．Angewandte Chemie-International Edition，2007，46（34）：6473－6475．

［13］SAXENA M，SARKAR S．Synthesis of carbogenic nanosphere from peanut skin［J］．Diamond and Related Materials，2012，24（1）：11－14．

［14］HSU P C，SHIH Z Y，LEE CH，et al．Synthesis and analytical applications of photoluminescent carbon nanodots［J］．Green Chemistry，2012，14（4）：917－920．

［15］ZHOU J J，SHENG Z H，HAN H Y，et al．Facile synthesis of fluorescent carbon dots using watermelon peel as a carbon source［J］．Materials Letters，2012，66（1）：222－224．

［16］KRYSMANN M J，KELARAKIS A，GIANNELIS E P．Photoluminescent carbogenic nanoparticles directly derived from crude biomass［J］．Green Chemistry，2012，14（11）：3141－3145．

［17］LU W，QIN X，LIU S，et al．Economical，green synthesis of fluorescent carbon nanoparticles and their use as probes for sensitive and selective detection of mercury（II）ions［J］．Analytical Chemistry，2012，84（12）：5351－5357．

［18］YANG Y，CUI J，ZHENG M，et al．One-step synthesis of amino-functionalized fluorescent carbon nanoparticles by hydrothermal carbonization of chitosan［J］．Chemical Communications，2012，48（3）：380－382．

［19］NIETO D C，RANGEL M J R．In situ transformation of agave bagasse into activated carbon by use of an environmental scanning electron microscope［J］．Microporous and Mesoporous Materials，2013，167（1）：249－253．

［20］PUMOMO C W，SALIM C，HINODE H．Effect of the activation method on the properties and adsorption behavior of bagasse fly ash-based activated carbon［J］．Fuel Processing Technology，2012，102（1）：132－139．

［21］SI W J，WU X Z，XING W，et al．Bagasse-based nanoporous carbon for supercapacitor application［J］．Journal of Inorganic Materials，2011，26（1）：107－112．

［責任編輯：劉蔚綏］

Facile synthesis of fluorescent carbon nanodots derived from biomass bagasse by hydrothermal treatment

CHEN Wenxin1，YANG Yunhua2，LIU Yingliang3，CAO Ximin4
（1．Department of Chemistry，School of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2．Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070，China；3．College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；4．Mei Le Shi Printing Ink Company Limited，Qingyuan 511500，China）

We developed a hydrothermal carbonization route to prepare carbon quantum dots（CQDs）by using sugarcane bagasse-an agricultural waste as carbon precursor．The obtained CQDs had a size distribution of 5～10 nm．The fluorescence property of the CQDs was the same as the other carbon dots，having multiple excitation and multiple emission．

fluorescent carbon dots；sugarcane bagasse；hydrothermal carbonization；cell imaging

O613．71

A

1000－9965（2015）01－0001－06

10．11778／j．jdxb．2015．01．001

2014－10－09

陳文新（1978－），男，研究方向：生物納米材料與技術

劉應亮，教授，研究方向：碳材料和發(fā)光材料．Tel：020－85221813；E-mail：tliuyl＠163．com