液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測牛奶中的四環(huán)素類藥物

文∕賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

四環(huán)素類藥物（tetracyclines，TCs）為一類具有共同多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、螺旋體、霉形體、立克次氏體、衣原體、原蟲等均可產生抑制作用，故又稱為廣譜抗生素。但該類藥物的不合理使用及濫用會誘導動物體內耐藥菌株的產生并可導致牛奶中該類藥物的殘留問題，對人類健康造成影響，如四環(huán)素類藥物易與骨骼中的鈣結合，抑制骨骼和牙齒的生長；治療劑量的四環(huán)素還具有致癌作用等。本文以液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測牛奶中的四環(huán)素類藥物殘留，結果表明，該方法具有較好的靈敏度、準確度和精密度。

1 方法

試料中殘留的四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素經Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取，HLB柱凈化。用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，外標法定量。

2 試劑和儀器設備

2.1 試劑

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

標準品：鹽酸四環(huán)素（純度≥97%），鹽酸土霉素（純度≥96%），鹽酸金霉素（純度≥93%），多西環(huán)素（純度≥93%）；甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；甲酸；氫氧化鈉；檸檬酸（C6H8O7?H2O）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）；乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8?2H2O）；氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取氫氧化鈉4 g，加水溶解并稀釋至100 mL，即得；檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取21.01 g檸檬酸，用水溶解并定容至1 000 mL，即得；磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取28.41 g磷酸氫二鈉，用水溶解并定容至1 000 mL，即得；Mcllvaine緩沖液：將0.1 mol/L檸檬酸溶液1 000 mL與0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液625 mL混合，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至4.0±0.5；Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液（0.1mol/L）：稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入 1 625 mL Mcllvaine緩沖液中，使其溶解，搖勻即得；1 mg/mL標準儲備液：準確稱取適量的鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素和鹽酸金霉素對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成濃度均為1 mg/mL的溶液，作為標準儲備液，置-20 ℃冰箱中保存，有效期為1 個月；標準工作液：準確量取標準儲備液適量，用甲醇-水（3∶7，V/V）溶液稀釋成適宜濃度的四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素標準工作液，臨用前配制。

2.2 儀器和設備

液相色譜-串聯(lián)質譜儀（配電噴霧離子源）；分析天平：感量0.00001 g；天平：感量0.01 g；渦旋混合器；水平振蕩器；組織勻漿機；離心機；酸度計；離心管：50 mL；固相萃取柱：HLB小柱（60 mg/3 cc）；氮吹儀；微孔濾膜：0.22 μm。

3 測定步驟

3.1 試料的制備

取混勻后的供試樣品，作為供試試料；取混勻后的空白樣品，作為空白試料；取混勻后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。

3.2 提取

稱?。?±0.05）g混合均勻的牛奶樣品，置50 mL離心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液18 mL，渦旋混勻，8 000 r/min離心10 min（溫度低于15 ℃），取上清液于另一離心管內備用。

3.3 凈化

HLB小柱依次用甲醇、水各5 mL預洗。取備用液10 mL過柱，依次用水、5%甲醇水溶液各5 mL淋洗，減壓抽干。用甲醇-乙酸乙酯溶液（1∶9，V/V）3 mL洗脫，洗脫液用氮氣吹干（溫度低于40 ℃）。用甲醇-水（3∶7，V/V）0.5 mL溶解殘余物，過濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

3.4 標準曲線的制備

精密量取標準儲備液適量，用甲醇-水（3∶7，V/V）溶液稀釋成含四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素分別為10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列工作液，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

3.5 測定

3.5.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（5 mm0×2.1 mm，1.7 μm），或相當者；流動相A：0.3%的甲酸乙腈溶液；流動相B：0.3%的甲酸水溶液；梯度洗脫：0～5 min，15%A線性變化至35%A，5～6 min，35%A線性變化至15%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL。

3.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；電離電壓：2.5 kV；源溫：100 ℃；霧化溫度：300 ℃。錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：500 L/h；定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量見表1。

3.5.3 測定方法

取試樣溶液和相應的標準溶液，作單點或多點校準，按外標法以峰面積計算。對照溶液及試樣溶液中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內?？瞻讓嶒灒撼患釉嚵贤猓捎猛耆嗤臏y定步驟進行平行操作。

3.5.4 結果計算和表述

按下式計算試料中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的殘留量：

式中:

X——試料中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的殘留量（ng/g）；

A——試樣溶液中相應藥物的峰面積；

AS——標準溶液中相應藥物的峰面積；

cs——標準溶液中相應藥物的濃度（ng/mL）；

V1——提取試料后緩沖液的總體積（mL）；

V2——過固相萃取柱所用備用液體積（mL）；

V3——溶解殘余物的體積（mL）；

m——供試試料的質量（g）。

注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留3 位有效數字。

3.6 檢測方法靈敏度、準確度、精密度

3.6.1 靈敏度

四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素在牛奶中的檢測限為5 ng/g，定量限為10 ng/g。

3.6.2 準確度

本方法在10～200 ng/g添加濃度的回收率為70%～120%。

3.6.3 精密度

本方法的批內變異系數≤20%，批間變異系數≤20%。

4 結果討論

4.1 研究用液質聯(lián)用法檢測牛奶中四環(huán)素類藥物的意義

歐盟和我國政府都規(guī)定了牛奶中四環(huán)素類藥物的最高殘留限量，即四環(huán)素、土霉素和金霉素的單個或混合物含量不得超過100 μg/kg。目前，TCs類藥物殘留檢測方法主要有：微生物法、酶聯(lián)免疫法（ELISA法）和液相色譜法（HPLC法），但這些方法存在特異性差等缺點。液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS法）由于具有特異性強和靈敏度高的特點，常用于獸藥殘留的結構確證分析。目前，國外已有不少用LC-MS/MS法測定動物性食品中TCs類藥物殘留的報道，國內相對來說起步較晚，報道也不多。本文以牛奶為試材，建立了LC-MS/MS法檢測TCs類藥物殘留的方法，可為牛奶樣品中TCs類藥物的殘留監(jiān)控和監(jiān)督檢驗等提供技術支持。

4.2 方法的編寫過程

在本方法研制過程中，通過查閱有關文獻，全面掌握了四環(huán)素類藥物的化學結構、理化性質、藥理毒理作用等，尤其是該類藥物的不穩(wěn)定性：TCs類藥物為金黃色或黃色晶粉，無臭，味苦，遇光色漸變暗，需密封、避光、干燥處保存；易溶于水，但水溶液穩(wěn)定性差，一般均需新鮮配制，可置于低溫下保存；較強酸性環(huán)境（pH值＜2.0）中可降解生成脫水四環(huán)素，弱酸性環(huán)境（pH值2.0～6.0）中可發(fā)生差向異構化，形成差向四環(huán)素，堿性環(huán)境（pH值＞7.0）下降解生成內酯結構的異四環(huán)素。在對該類藥物材料全面掌握的基礎上，參照美國農業(yè)部食品安全與監(jiān)督署（FSIS）頒布的己有的檢測方法中前處理方法，針對牛奶的檢測方法進行多次實驗，發(fā)現結果能很好滿足歐盟、美國和我國在制定獸藥殘留檢測方法方面的要求，并通過具體實驗數據的實驗，最終確定了該方法的可行性。

4.3 提取條件的確定

由于甲醇、乙腈等有機溶劑提取的樣品峰形和靈敏度較差，水溶液的穩(wěn)定性較差，因此在提取時用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液（pH值=4.0±0.5），這樣既可以利用EDTA絡合劑與系統(tǒng)內的金屬離子進行結合，同時該pH值也能保證該類藥物的穩(wěn)定性，另外在離心過程中溫度控制在15 ℃以內，也能防止該類藥物的改變分解。

4.4 凈化條件的確定

本方法使用Oasis HLB固相萃取小柱，使得方法的回收率以及重復性穩(wěn)定可靠。過柱后洗脫液用氮氣吹干時溫度控制在40 ℃以內，殘余物用30%的甲醇水溶液溶解，也能確保其穩(wěn)定性和靈敏度。

4.5 離子對的確定

TCs類藥物屬于歐盟指令96/23/EC附錄ⅠB組所列物質，根據歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質，至少需要3 個識別點（IP），因此，實驗中選擇了母離

表2 牛奶中四環(huán)素類藥物的添加回收率結果

子以及對應產生的2 個響應較強的子離子作為定性定量的依據，可以達到4 個IP點的要求，這樣完全按照違禁藥物對IP點的要求進行方法定性分析，可以獲得要求更嚴格的結果。

4.6 線性范圍

分別取四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素標準儲備液適量，用甲醇稀釋定容成100 μg/mL，再用30%甲醇水溶液稀釋成1 μg/mL的混合標液，依次取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL于10 mL容量瓶內，用30%甲醇稀釋定容至刻度，制得10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標液，按低濃度到高濃度的順序依次進樣，結果以系列標液濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標進行線性回歸，得出的回歸方程及R2值表明：四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素在10～500 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，R2均大于0.990（圖1）。

圖1 四環(huán)素類藥物標準曲線

4.7 方法的靈敏度

空白試料按相同的步驟處理后，測定結果表明：在相應的保留時間，空白試料對所測分析物無干擾。定量限（LOQ）：進行添加濃度為10 ng/g的標準添加時，經提取后測定，發(fā)現信噪比S/N＞10（按PtP算），表明方法的定量限為10 ng/g。檢測限（LOD）：進行添加濃度為5 ng/g的標準添加時，經提取后測定，發(fā)現信噪比S/N＞3（按PtP算），表明方法的檢測限為5 ng/g。

4.8 檢測方法的精密度實驗

采用標準添加法，在空白牛奶中添加4 個不同濃度（定量限，低、中、高濃度）的四環(huán)素類藥物進行回收率實驗，各濃度進行5 個樣品平行實驗，重復3次，求出批內、批間相對標準偏差（表2）。

4.9 McIlvaine-Na2EDTA 緩沖液的配制

對于Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液的配制可以采用本方法中的配制方法配制，且每種化合物都使用其帶結晶水的化合物來稱量配制，使用時要選好帶有多少個結晶水，如果和標準中的結晶水的數量不一致時可以進行適當折算，然后再配制。

4.10 固相萃取柱的選擇

對于實驗中使用的萃取柱理論上市場上出售的C18柱和HLB柱都能滿足前處理的要求，但在使用C18柱時一定要注意不能在預洗活化以及上樣過程中出現柱床干涸現象，否則對四環(huán)素類藥物的回收率影響很大，為避免此現象的發(fā)生，最好使用親水親脂的HLB柱子，該柱子柱床是否干涸對回收率基本沒有影響。另外，在使用時考慮到是否容易過柱，可以使用60 mg/3 cc較大規(guī)格的柱子。根據實際實驗，在處理牛奶樣品時使用60 mg/3 cc的HLB柱子含給前處理過程帶來很大便利。

5 結論

采用液相色譜-串聯(lián)質譜技術、外標法定量測定了牛奶中四環(huán)素類藥物，明確規(guī)定了方法的適用范圍，確定了取樣量、提取凈化方法和液相色譜-串聯(lián)質譜條件等。結果表明，該方法具有較好的靈敏度、準確度和精密度。