朱 群,王二柱,常 娟,尹清強(qiáng)(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南鄭州450002)
抗生素對(duì)特異性的微生物具有抑制或殺滅作用[1],作為一種抗菌消炎藥,在過(guò)去的幾十年內(nèi)在治療和預(yù)防動(dòng)物疾病上給人們帶來(lái)了很多的益處,但同時(shí)也帶來(lái)許多負(fù)面影響。因?yàn)樗跉⑺乐虏【耐瑫r(shí),對(duì)有益菌也有一定的殺滅作用,隨著抗藥和耐藥菌及“超級(jí)病菌”的出現(xiàn),人們加大了抗生素的用量,導(dǎo)致藥物殘留等畜產(chǎn)品安全問(wèn)題日益嚴(yán)重,給人們的健康帶來(lái)了不良影響,尋找抗生素替代品成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
益生菌是一種活菌制劑,其本身及其代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物機(jī)體能夠發(fā)揮有益的作用[2],作為一種新的飼料添加劑逐漸為人們所熟知。益生菌能夠在數(shù)量上和種類(lèi)上補(bǔ)充腸道內(nèi)缺乏的微生物菌群,當(dāng)其在動(dòng)物腸道內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)能調(diào)整并維持腸道內(nèi)正常的微生態(tài)平衡,抑制有害微生物的生長(zhǎng)[3],益生菌的體外抑菌試驗(yàn)可以采用牛津杯法測(cè)定[4]。益生菌的抑菌能力歸因于其種群優(yōu)勢(shì)、競(jìng)爭(zhēng)性抑制及其代謝產(chǎn)物(如乳酸等)。有些益生菌(如芽孢桿菌)雖然不能在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期定植,但是當(dāng)其經(jīng)過(guò)腸道時(shí)利用種群優(yōu)勢(shì)發(fā)揮生物奪氧的功能,從而抑制其他需氧菌的生長(zhǎng),同時(shí)還能產(chǎn)生多種維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供動(dòng)物體吸收利用[5]?;谝嫔莫?dú)特優(yōu)勢(shì),它逐漸在動(dòng)物生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用[6-7]。
金霉素(Chlortetracycline),又名氯四環(huán)素,屬于廣譜抗生素,許多立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、非典型分枝桿菌屬、螺旋體對(duì)金霉素敏感。隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)重視度的不斷提高,抗生素的禁止和限制使用越來(lái)越普遍。盡管抗生素對(duì)致病菌和益生菌都具有殺滅作用,但有研究表明抗生素與益生菌的聯(lián)合使用也能達(dá)到很好的效果[8-9]。為了探討金霉素和益生菌聯(lián)合抑制致病菌生長(zhǎng)的效果,使金霉素在低劑量的情況下發(fā)揮最大的抑菌和促生產(chǎn)作用,筆者選用乳酪桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母4種益生菌和金霉素配比研究其對(duì)致病菌性大腸桿菌的抑制作用,探討金霉素與微生態(tài)制劑的最佳配伍比例,為益生菌和抗生素的配伍使用提供理論依據(jù),以期獲得一種新型的飼料添加劑或高效的治療動(dòng)物消化道疾病的復(fù)合藥物制劑。
1.1 金霉素與微生物 金霉素由河南駐馬店華中正大有限公司提供,其標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為:樣品置于干燥器中干燥12 h后,準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g樣品(精確到0.000 2 g)加0.1 mol/L鹽酸30 ml攪拌5 h后定容至50 ml,在無(wú)菌條件下用0.2 μm濾膜過(guò)濾,配置成9 000 U/ml的無(wú)菌金霉素溶液,然后通過(guò)不同梯度的稀釋?zhuān)苽浣鹈顾睾糠謩e為75、150、200、300、400、500和600 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。益生菌:枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母、乳酪桿菌、糞腸球菌和大腸桿菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 培養(yǎng)基
1.2.1 培養(yǎng)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、用蒸餾水定容至1 L,pH 為7.0 ~7.2,在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌 20 min。接種大腸桿菌后,37℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h。
1.2.2 大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基-伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。蛋白胨10 g、乳糖 10 g、磷酸氫二鉀 2 g、瓊脂 14 g、伊紅 0.4 g、美蘭0.065 g,定容至1 L,pH 為7.2 ±0.4,在 0.15 MPa 高壓下蒸汽滅菌20 min。平皿接種微生物后在37℃培養(yǎng)48 h,然后記錄大腸桿菌的菌落數(shù)(具有金屬光澤的菌落),以對(duì)數(shù)(lg)形式表示。
1.2.3 培養(yǎng)乳酸桿菌和糞腸球菌的MRS培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐溫(80)1 ml、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉 2 g、硫酸鎂200 mg、硫酸錳50 mg,用蒸餾水定容至1 L,pH 為6.2 ~6.6,在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種乳酸桿菌后,37℃下靜止培養(yǎng)48 h。
1.2.4 培養(yǎng)酵母菌的YPD培養(yǎng)基。酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g,用蒸餾水定容至1 L,pH 為7.0 ~7.2,在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種酵母菌后,30℃下振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌的抑菌作用。按照4因素4水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),先將單獨(dú)益生菌培養(yǎng)液用培養(yǎng)基稀釋至活菌數(shù)為1×108個(gè)/ml,然后按4因素4水平表配制成復(fù)合益生菌制劑。將大腸桿菌的培養(yǎng)液均勻的涂布在已加入固體培養(yǎng)基的平皿中,待其完全吸收后放入牛津杯,向牛津杯中加入100 μl復(fù)合益生菌菌液,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),放于4℃條件下吸收4 h,然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈直徑。
1.3.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。按照“1.3.1”選出的復(fù)合益生菌最優(yōu)組合,加入一定量的金霉素,配制成含不同金霉素濃度的復(fù)合益生菌制劑。另外,以不同濃度的單一金霉素作為對(duì)照組,按照“1.3.1”中方法測(cè)定抑菌圈大小。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),以P<0.05為差異顯著。
2.1 復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用 從表1可以看出,復(fù)合益生菌抑制大腸桿菌的最佳組合為枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌 =2∶1∶3∶4(P <0.05)。
2.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用 由表2可知,隨著金霉素濃度的提高,無(wú)論是單一的金霉素還是其與益生菌的復(fù)合物,其抑菌作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。單獨(dú)復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用與75~150 mg/L的金霉素相當(dāng)。當(dāng)150 mg/L金霉素與益生菌配合后,其抑菌效果與單獨(dú)300~400 mg/L金霉素作用相當(dāng);而當(dāng)400 mg/L金霉素與益生菌配合后,其抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)600 mg/L金霉素的作用。由此可知,低濃度金霉素與復(fù)合益生菌配合后,可以達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果。
3.1 單獨(dú)復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用 益生菌作為動(dòng)物體內(nèi)的一部分與機(jī)體的健康密切相關(guān),其中一個(gè)很重要的作用就是抑制病原微生物的生長(zhǎng),維持腸道微生物區(qū)系平衡[10]。該研究結(jié)果表明,各種益生菌添加比例不同,其對(duì)大腸桿菌的抑制作用也不同,說(shuō)明4種益生菌分別抑制大腸桿菌的能力有一定的差異,并存在一定的協(xié)同性。據(jù)報(bào)道,芽孢桿菌和乳酸菌之間利用生物奪氧和改變環(huán)境的酸堿度的方式進(jìn)行協(xié)同抗菌[11-12],與該研究結(jié)果相一致。
表1 復(fù)合益生菌組合對(duì)大腸桿菌的抑制效果
表2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑
3.2 復(fù)合益生菌與金霉素聯(lián)合對(duì)大腸桿菌的抑制作用 該試驗(yàn)所用的金霉素作為一種廣譜抗菌藥,對(duì)很多細(xì)菌都有抑制作用。但是,有研究表明有些益生菌的基因組內(nèi)存在抗性基因,對(duì)抗生素有一定的耐藥性[13-14],這就為益生菌與抗生素的聯(lián)合使用提供了依據(jù)。該研究結(jié)果表明單獨(dú)益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用要高于益生菌和75 mg/L的金霉素聯(lián)合作用的效果,并且當(dāng)金霉素濃度高于75 mg/L時(shí),聯(lián)合作用的效果都要高于單獨(dú)金霉素和單獨(dú)益生菌的作用。這說(shuō)明復(fù)合益生菌對(duì)金霉素有一定的抵抗能力,同時(shí)也能與抗生素協(xié)同抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。馬艷等[15]研究結(jié)果也表明益生菌可以與一些抗生素的聯(lián)合使用,并且益生菌的復(fù)合應(yīng)用還可以降低單株菌對(duì)某些抗生素的敏感性,從而擴(kuò)大了益生菌與抗生素配伍使用的范圍。
筆者通過(guò)益生菌和抗生素單獨(dú)及聯(lián)合使用,可以看出單獨(dú)益生菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用與75~150 mg/L金霉素相當(dāng),說(shuō)明復(fù)合益生菌具有低濃度金霉素的作用效果,而且聯(lián)合使用的效果要比單獨(dú)使用金霉素效果要好。在實(shí)際應(yīng)用中,借助益生菌的聯(lián)合應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)低劑量金霉素的添加,達(dá)到高劑量金霉素的效果。這對(duì)于減少抗藥和耐藥菌的產(chǎn)生、減少藥物殘留、維持機(jī)體微生態(tài)平衡及提高畜產(chǎn)品的安全性具有重要意義。
該試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)復(fù)合益生菌與金霉素聯(lián)合使用時(shí),其抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)使用金霉素或益生菌。同時(shí),可以使低劑量金霉素達(dá)到高劑量金霉素的抑菌效果,對(duì)于減少超級(jí)病原菌的產(chǎn)生及提高畜產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義重大。
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