復(fù)合益生菌與金霉素配合抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的研究

朱 群，王二柱，常 娟，尹清強(qiáng)(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002)

抗生素對(duì)特異性的微生物具有抑制或殺滅作用［1］，作為一種抗菌消炎藥，在過(guò)去的幾十年內(nèi)在治療和預(yù)防動(dòng)物疾病上給人們帶來(lái)了很多的益處，但同時(shí)也帶來(lái)許多負(fù)面影響。因?yàn)樗跉⑺乐虏【耐瑫r(shí)，對(duì)有益菌也有一定的殺滅作用，隨著抗藥和耐藥菌及“超級(jí)病菌”的出現(xiàn)，人們加大了抗生素的用量，導(dǎo)致藥物殘留等畜產(chǎn)品安全問(wèn)題日益嚴(yán)重，給人們的健康帶來(lái)了不良影響，尋找抗生素替代品成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

益生菌是一種活菌制劑，其本身及其代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物機(jī)體能夠發(fā)揮有益的作用［2］，作為一種新的飼料添加劑逐漸為人們所熟知。益生菌能夠在數(shù)量上和種類(lèi)上補(bǔ)充腸道內(nèi)缺乏的微生物菌群，當(dāng)其在動(dòng)物腸道內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)能調(diào)整并維持腸道內(nèi)正常的微生態(tài)平衡，抑制有害微生物的生長(zhǎng)［3］，益生菌的體外抑菌試驗(yàn)可以采用牛津杯法測(cè)定［4］。益生菌的抑菌能力歸因于其種群優(yōu)勢(shì)、競(jìng)爭(zhēng)性抑制及其代謝產(chǎn)物(如乳酸等)。有些益生菌(如芽孢桿菌)雖然不能在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期定植，但是當(dāng)其經(jīng)過(guò)腸道時(shí)利用種群優(yōu)勢(shì)發(fā)揮生物奪氧的功能，從而抑制其他需氧菌的生長(zhǎng)，同時(shí)還能產(chǎn)生多種維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供動(dòng)物體吸收利用［5］?；谝嫔莫?dú)特優(yōu)勢(shì)，它逐漸在動(dòng)物生產(chǎn)中得以廣泛應(yīng)用［6－7］。

金霉素(Chlortetracycline)，又名氯四環(huán)素，屬于廣譜抗生素，許多立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、非典型分枝桿菌屬、螺旋體對(duì)金霉素敏感。隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)重視度的不斷提高，抗生素的禁止和限制使用越來(lái)越普遍。盡管抗生素對(duì)致病菌和益生菌都具有殺滅作用，但有研究表明抗生素與益生菌的聯(lián)合使用也能達(dá)到很好的效果［8－9］。為了探討金霉素和益生菌聯(lián)合抑制致病菌生長(zhǎng)的效果，使金霉素在低劑量的情況下發(fā)揮最大的抑菌和促生產(chǎn)作用，筆者選用乳酪桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母4種益生菌和金霉素配比研究其對(duì)致病菌性大腸桿菌的抑制作用，探討金霉素與微生態(tài)制劑的最佳配伍比例，為益生菌和抗生素的配伍使用提供理論依據(jù)，以期獲得一種新型的飼料添加劑或高效的治療動(dòng)物消化道疾病的復(fù)合藥物制劑。

1 材料與方法

1.1 金霉素與微生物 金霉素由河南駐馬店華中正大有限公司提供，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為:樣品置于干燥器中干燥12 h后，準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g樣品(精確到0.000 2 g)加0.1 mol/L鹽酸30 ml攪拌5 h后定容至50 ml，在無(wú)菌條件下用0.2 μm濾膜過(guò)濾，配置成9 000 U/ml的無(wú)菌金霉素溶液，然后通過(guò)不同梯度的稀釋?zhuān)苽浣鹈顾睾糠謩e為75、150、200、300、400、500和600 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。益生菌:枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母、乳酪桿菌、糞腸球菌和大腸桿菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 培養(yǎng)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、用蒸餾水定容至1 L，pH 為7.0 ～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌 20 min。接種大腸桿菌后，37℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基－伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。蛋白胨10 g、乳糖 10 g、磷酸氫二鉀 2 g、瓊脂 14 g、伊紅 0.4 g、美蘭0.065 g，定容至1 L，pH 為7.2 ±0.4，在 0.15 MPa 高壓下蒸汽滅菌20 min。平皿接種微生物后在37℃培養(yǎng)48 h，然后記錄大腸桿菌的菌落數(shù)(具有金屬光澤的菌落)，以對(duì)數(shù)(lg)形式表示。

1.2.3 培養(yǎng)乳酸桿菌和糞腸球菌的MRS培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐溫(80)1 ml、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉 2 g、硫酸鎂200 mg、硫酸錳50 mg，用蒸餾水定容至1 L，pH 為6.2 ～6.6，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種乳酸桿菌后，37℃下靜止培養(yǎng)48 h。

1.2.4 培養(yǎng)酵母菌的YPD培養(yǎng)基。酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 L，pH 為7.0 ～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種酵母菌后，30℃下振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌的抑菌作用。按照4因素4水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，先將單獨(dú)益生菌培養(yǎng)液用培養(yǎng)基稀釋至活菌數(shù)為1×108個(gè)/ml，然后按4因素4水平表配制成復(fù)合益生菌制劑。將大腸桿菌的培養(yǎng)液均勻的涂布在已加入固體培養(yǎng)基的平皿中，待其完全吸收后放入牛津杯，向牛津杯中加入100 μl復(fù)合益生菌菌液，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，放于4℃條件下吸收4 h，然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。按照“1.3.1”選出的復(fù)合益生菌最優(yōu)組合，加入一定量的金霉素，配制成含不同金霉素濃度的復(fù)合益生菌制劑。另外，以不同濃度的單一金霉素作為對(duì)照組，按照“1.3.1”中方法測(cè)定抑菌圈大小。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用 從表1可以看出，復(fù)合益生菌抑制大腸桿菌的最佳組合為枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌 =2∶1∶3∶4(P ＜0.05)。

2.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用 由表2可知，隨著金霉素濃度的提高，無(wú)論是單一的金霉素還是其與益生菌的復(fù)合物，其抑菌作用逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)。單獨(dú)復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用與75～150 mg/L的金霉素相當(dāng)。當(dāng)150 mg/L金霉素與益生菌配合后，其抑菌效果與單獨(dú)300～400 mg/L金霉素作用相當(dāng);而當(dāng)400 mg/L金霉素與益生菌配合后，其抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)600 mg/L金霉素的作用。由此可知，低濃度金霉素與復(fù)合益生菌配合后，可以達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果。

3 討論與結(jié)論

3.1 單獨(dú)復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用 益生菌作為動(dòng)物體內(nèi)的一部分與機(jī)體的健康密切相關(guān)，其中一個(gè)很重要的作用就是抑制病原微生物的生長(zhǎng)，維持腸道微生物區(qū)系平衡［10］。該研究結(jié)果表明，各種益生菌添加比例不同，其對(duì)大腸桿菌的抑制作用也不同，說(shuō)明4種益生菌分別抑制大腸桿菌的能力有一定的差異，并存在一定的協(xié)同性。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌和乳酸菌之間利用生物奪氧和改變環(huán)境的酸堿度的方式進(jìn)行協(xié)同抗菌［11－12］，與該研究結(jié)果相一致。

表1 復(fù)合益生菌組合對(duì)大腸桿菌的抑制效果

表2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑

3.2 復(fù)合益生菌與金霉素聯(lián)合對(duì)大腸桿菌的抑制作用 該試驗(yàn)所用的金霉素作為一種廣譜抗菌藥，對(duì)很多細(xì)菌都有抑制作用。但是，有研究表明有些益生菌的基因組內(nèi)存在抗性基因，對(duì)抗生素有一定的耐藥性［13－14］，這就為益生菌與抗生素的聯(lián)合使用提供了依據(jù)。該研究結(jié)果表明單獨(dú)益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用要高于益生菌和75 mg/L的金霉素聯(lián)合作用的效果，并且當(dāng)金霉素濃度高于75 mg/L時(shí)，聯(lián)合作用的效果都要高于單獨(dú)金霉素和單獨(dú)益生菌的作用。這說(shuō)明復(fù)合益生菌對(duì)金霉素有一定的抵抗能力，同時(shí)也能與抗生素協(xié)同抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。馬艷等［15］研究結(jié)果也表明益生菌可以與一些抗生素的聯(lián)合使用，并且益生菌的復(fù)合應(yīng)用還可以降低單株菌對(duì)某些抗生素的敏感性，從而擴(kuò)大了益生菌與抗生素配伍使用的范圍。

筆者通過(guò)益生菌和抗生素單獨(dú)及聯(lián)合使用，可以看出單獨(dú)益生菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用與75～150 mg/L金霉素相當(dāng)，說(shuō)明復(fù)合益生菌具有低濃度金霉素的作用效果，而且聯(lián)合使用的效果要比單獨(dú)使用金霉素效果要好。在實(shí)際應(yīng)用中，借助益生菌的聯(lián)合應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)低劑量金霉素的添加，達(dá)到高劑量金霉素的效果。這對(duì)于減少抗藥和耐藥菌的產(chǎn)生、減少藥物殘留、維持機(jī)體微生態(tài)平衡及提高畜產(chǎn)品的安全性具有重要意義。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合益生菌與金霉素聯(lián)合使用時(shí)，其抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)使用金霉素或益生菌。同時(shí)，可以使低劑量金霉素達(dá)到高劑量金霉素的抑菌效果，對(duì)于減少超級(jí)病原菌的產(chǎn)生及提高畜產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義重大。

［1］楊云裳，薛飛群.抗生素飼料添加劑研究概況［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2000(5):38－40.

［2］尹清強(qiáng)，李小飛，常娟，等.微生態(tài)制劑對(duì)哺乳和斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響及作用機(jī)理研究［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(4):622 －629.

［3］GOTCHEVA E，HRISTOZOVA E，HRISTOZOVA T，et al.Assessment of potential probiotic properties of Lactic acid bacteria and yeast strains［J］.Food Biotechnology，2002，16(3):211 －225.

［4］劉冬梅，李理，楊曉泉，等.用牛津杯法測(cè)定益生菌抑菌活力［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(3):110 －111.

［5］張民，刁其玉.益生菌的營(yíng)養(yǎng)和免疫特性及其應(yīng)用［J］.飼料研究，2002(10):6 －8.

［6］ZUBILLAGA M，WEILL R，POSTAIRE E，et al.Effect of probiotics and functional foods and their use in different diseases［J］.Nutrition Research，2001，21(3):569 －579.

［7］OSO AO，IDOWU OMO，HAASTRUP AS，et al.Growth performance，apparent nutrient digestibility，caecal fermentation，ileal morphology and caecal microflora of growing rabbits fed diets containing probiotics and prebiotics［J］.Livestock Science，2013，157(1):184 －190.

［8］呂東海，周巖民，王國(guó)華，等.益生素與抗生素對(duì)肉鴨生產(chǎn)性能影響的試驗(yàn)［J］.廣東飼料，2001，10(6):16 －17.

［9］趙智華.抗生素與益生素組合對(duì)肉鴨生產(chǎn)性能的影響［J］.飼料工業(yè)，2002，23(7):11 －13.

［10］TUOHY KM，PROBERT HM，SMEJKAL CW.Using probiotics and prebiotics to improve gut health［J］.Drug Discovery Today，2003，8(15):692 －700.

［11］李鐵軍，李?lèi)?ài)云，張曉峰.乳酸菌抗菌機(jī)理研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2002，29(5):81 －85.

［12］ASAHARA T，SHIMIZU K，NOMOTO K，et al.Probiotic bifidobacteria protect mice from lethal infect ion with Shiga toxin producing Escherichia coli 0157:H7［J］.Infection and Immunity，2004，72(4):2240 －2247.

［13］AIRES J，DOUCET-POPULAIRE F，BUTEL MJ.Tetracycline resistance mediated by tet(W)，tet(M)，and tet(O)genes of Bifidobacterium isolates from humans［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(8):2751－2754.

［14］EGERVARN M，ROOS S，LINDMARK H.Identification and characterization of antibiotic resistance genes in Lactobacillus reuteri and Lactobacillus plantarum［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，107(5):1658 －1668.

［15］馬艷，常志州，朱萬(wàn)寶，等.飼用益生菌對(duì)抗生素敏感性的試驗(yàn)研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002(5):50－52.