LEA蛋白特征片段及海藻糖對熱敏性蛋白藥物胰島素凍干的協(xié)同保護

劉立李代禧郭柏松潘琦余華星柴培劉寶林楊春生

（1上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海東富龍科技股份有限公司 上海 201108）

LEA蛋白特征片段及海藻糖對熱敏性蛋白藥物胰島素凍干的協(xié)同保護

劉立1李代禧1郭柏松2潘琦1余華星1柴培1劉寶林1楊春生2

（1上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海東富龍科技股份有限公司 上海 201108）

熱敏性蛋白藥物胰島素的熱穩(wěn)定性較差，極易受制備方式和保存條件等影響而失活。故本研究分別利用高效液相色譜（HPLC）測定凍干樣品中胰島素的效價和差示掃描量熱儀（DSC）測定凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等重要參數(shù)，來研究胚胎發(fā)育晚期富集蛋白特征片段（LEA?motif，LEAM）和海藻糖凍干保護劑對胰島素凍干保護效果的影響。凍干實驗表明，兩種保護劑均對胰島素的活性具有保護效果，且LEAM的活性保護效果優(yōu)于海藻糖。在效價和熱穩(wěn)定性方面，LEAM保護的胰島素凍干品均高于海藻糖保護的胰島素凍干樣品。更為重要的是，兩種保護劑協(xié)同保護時，少量海藻糖對于LEAM的保護特性具有增效作用。在凍干過程中，可有效提升藥物玻璃態(tài)的穩(wěn)定性，防止熱致變性失活。由此可見，這種LEAM和海藻糖保護劑復(fù)合保護方法有望也可以應(yīng)用在熱敏性蛋白藥物凍干粉針制備過程以保護藥物活性。

LEA蛋白特征片段；胰島素；海藻糖；冷凍干燥；活性保護

胰島素（Insulin）是機體內(nèi)唯一降低血糖的蛋白質(zhì)激素。人體內(nèi)缺乏胰島素會導(dǎo)致高血糖，引發(fā)糖尿?。?］，故常用胰島素來治療糖尿病。胰島素的傳統(tǒng)給藥方式為皮下注射法。此外，肺部吸入給藥也是比較可行的非注射給藥途徑［2］。Alkenmes公司與Lilly公司聯(lián)合研制了AIR系統(tǒng)。AIR給藥裝置是呼吸促發(fā)型被動裝置［3］。由于吸入型胰島素主要采用真空冷凍干燥的方式制備，為防止熱敏性蛋白藥物胰島素失活，制備凍干粉劑時常加入輔料［4］（如糖類，氨基酸和脂類），但收效甚微，藥品活性仍有較大損失，且儲存穩(wěn)定性較差。因此，迫切需要尋求一種行之有效的保護劑，在凍干過程中不僅保護胰島素活性，而且提升藥物的儲存穩(wěn)定性。由于含有LEA蛋白的生物能夠迅速適應(yīng)高溫或低溫導(dǎo)致的極度缺水環(huán)境［5－10］，故本文選取線蟲中第三組 LEA蛋白中的AavLEA1蛋白的K47?E57的11個氨基酸的特征重復(fù)片段（LEA?motif，LEAM）作為保護劑［11］。

效價是生物制品活性（數(shù)量）高低的標志，可用來表征生物制品的活性。最初對胰島素活性的測定基本采用小鼠生物活性效價檢定法。由于此方法個體差異大、耗時長、操作繁瑣，而高效液相色譜法操作簡便、測量精密度高，故美國、英國藥典近來均將高效液相色譜法測定效價納入胰島素的效價測定方法［12］。因此，本文選用高效液相色譜法（High per?formance liquid chromatograph，HPLC）測定效價，研究LEAM和海藻糖對胰島素的協(xié)同保護作用。首先，利用HPLC測定胰島素效價，分析不同保護劑配比對胰島素凍干活性保護效果，再利用差示掃描量熱儀（Differential scanning calorimetry，DSC）測定凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、熱焓松弛峰溫和熱焓松弛焓值，分析不同保護劑配比對凍干品熱穩(wěn)定性的影響，最終研究LEAM和海藻糖對胰島素的協(xié)同保護機理。

1 實驗材料與方法

1.1 材料和儀器

豬胰島素標準品，批號：140720?200901，中國藥品生物制品檢定所。豬胰島素，批號：1306A04，徐州萬邦金橋制藥有限公司，白色結(jié)晶性干粉，按干燥品計，每1 mg供試品的效價為28.3 IU。LEA蛋白特征重復(fù)片段，批號：LT130325，北京澤溪源生物科技有限公司，白色干粉，純度＞95%。海藻糖（Trehalose）為二水海藻糖，批號：061027，上海源聚生物科技有限公司，純度＞98%。鹽酸（Hydrochloric acid），批號：20091102，湖南爾康制藥有限公司，分析純。無水硫酸鈉（Sodium sulfate anhydrous），批號：20130830，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，為分析純。乙醇胺（Mo?noethanolamine），批號：20130228，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，為分析純。磷酸（Phosphoric acid），批號：20120618，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司，為分析純。乙腈（Acetonitrile）為色譜純試劑。實驗用水均為二次蒸餾水。

凍干機采用LYO?0.2型凍干機，上海東富龍科技股份有限公司。高效液相色譜儀由Waters e2695分離模塊和Waters 2998光電二極管檢測器組成，美國Waters公司。差示掃描量熱儀為DSC1，瑞士Mett?ler?Toledo公司?？栙M休滴定儀采用Mettler Toledo DL38卡爾費休滴定儀，瑞士Mettler?Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰島素保護劑溶液的配制

首先，配制成50 mL 4.2 mg／mL的豬胰島素溶液。再分別按照胰島素和保護劑不同的質(zhì)量比，加入適量保護劑，最后分裝成1 mL的溶液凍干。根據(jù)胰島素和保護劑的相關(guān)配比依次分成四組，具體數(shù)據(jù)詳見表1。實驗中所用溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 胰島素和保護劑配比Tab.1 The ratio of insu lin and p rotectant

1.2.2 樣品的凍干

樣品首先預(yù)凍至－45℃，持續(xù)1 h，一次干燥至－35℃，持續(xù)18 h，二次干燥至25℃，持續(xù)6 h，真空度為10 Pa［13］。凍干結(jié)束后，樣品無塌陷。樣品凍干完成后，利用卡爾費休滴定儀，測定凍干干粉的水分含量，水分含量均在3%左右。

1.2.3 HPLC測定胰島素效價

胰島素的效價測定利用反相色譜技術(shù)進行測定。色譜柱采用XBridge C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；以0.2 mol／L硫酸鹽緩沖液（取無水硫酸鈉28.4 g，加水溶解后，加磷酸2.7 mL，乙醇胺調(diào)節(jié)pH值至2.3，加水至1000 mL）?乙腈（74：26）為流動相；柱溫為40℃；檢測波長為214 nm。每次取樣20 uL，按照外標法獲得效價。凍干后樣品，均用等體積超純水復(fù)溶后測定。

1.2.4 DSC測定熱穩(wěn)定性

溫度和熱熔標定采用標樣銦和鋅的熔融過程（均采用外推起始溫度）進行兩點標定。標定速率為10℃／min，液氮冷卻采用Cryofab公司的液氮容器控制。樣品沖洗氣體為高純度氮氣（純度＞99.999%），流量20 mL／min保持不變。樣品量為5～10 mg，精確到±0.01 mg。天平采用梅特勒?托利多的XS205，精確到0.01 mg。樣品皿為40 uL標準液體鋁皿（上海笛柏實驗設(shè)備有限公司），用液固通用壓機（瑞士Mettler?Toledo公司）壓制。

表2 加入不同保護劑后凍干品外觀檢測結(jié)果Tab.2 The appearance of lyophilized insulin with different protectant

本實驗的測量溫度范圍為25～165℃。設(shè)定的實驗程序為從25℃開始，以5℃／min的升溫速率升溫至165℃。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度采用熱分析軟件STAReSoftware（瑞士 Mettler?Toledo公司，12.00版本）。取發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變的中點溫度為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，取熱焓松弛峰處的溫度為熱焓松弛峰溫，取熱焓松弛峰面積為熱焓松弛焓值。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍干樣品外觀表征

胰島素凍干的參照樣品和第1組LEAM保護的胰島素凍干樣品的外觀均為白色疏絮狀，帶有裂縫。而第2組海藻糖保護胰島素凍干樣品的外觀具有一定差異性，當胰島素和海藻糖的質(zhì)量比在1：1和1：2時，海藻糖保護的胰島素凍干樣品內(nèi)有些許裂縫，但當胰島素和海藻糖的質(zhì)量比在1：3以上時，海藻糖保護的胰島素凍干樣品內(nèi)的裂縫消失，外觀為白色絮狀物，外形完整。同時，第3組和第4組LEAM和海藻糖協(xié)同保護的胰島素凍干樣品的裂縫較LEAM保護的胰島素凍干樣品少。因此，海藻糖在外觀方面還可起賦形劑的作用。

2.2 保護劑對胰島素凍干樣品效價影響

圖1為胰島素標準品溶液的液相色譜圖。圖3 （c），3（e）和3（f）中的LEAM峰，胰島素峰和A?21脫酰胺峰均較好分離。由于糖類的分子量較小，利用反相色譜技術(shù)不能較好捕獲，因此圖3（d），3（e）和3 （f）上僅有胰島素峰、A?21脫酰胺胰島素峰及LEAM峰，無海藻糖峰。所有A?21脫酰胺峰的峰面積所占比例均小于5%，符合藥典規(guī)定標準［14］。

圖1 胰島素標準品曲線Fig.1 The HPLC curve of insulin standard solution

圖2 單一及協(xié)同保護劑保護的凍干品中胰島素效價減少量Fig.2 Proficiency decrement of lyophilized insulin w ithin only LEAM／trehalose and synergistical LEAM and trehalose

圖2為凍干前后不同質(zhì)量LEAM或海藻糖保護下胰島素的效價減少量對比柱形圖。發(fā)現(xiàn)未加任何保護劑凍干參照樣品，胰島素的效價從凍干前的46.50 IU／mL降低至凍干后的38.57 IU／mL，效價減少7.93 IU／mL，說明凍干會造成胰島素的效價下降，易使藥物失去活性。而第1組LEAM保護的凍干樣品中胰島素效價減少量約為1.69～2.25 IU／mL，且當胰島素和LEAM的質(zhì)量比1：7時，胰島素效價減少量最小，凍干保護效果相對其他濃度的胰島素?LEAM凍干品而言較優(yōu)。第2組海藻糖保護的凍干樣品中胰島素效價減少量約為3.28～6.39 IU／mL，當胰島素和海藻糖的質(zhì)量比為1：5時，胰島素效價減少量最小，凍干保護效果相對較優(yōu)。

圖3 胰島素溶液及相關(guān)凍干樣品的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography images

添加保護劑的胰島素凍干樣品效價減少量均低于未添加保護劑的胰島素凍干樣品效價減少量，說明LEAM和海藻糖均對胰島素的凍干具有活性保護作用，能有效防止胰島素由于凍干而引起的失活，且LEAM比海藻糖對胰島素的凍干保護效果更好。

圖2還表明了LEAM和海藻糖對胰島素協(xié)同保護效果。第3組胰島素樣品中同時添加不同質(zhì)量比的LEAM和海藻糖做凍干活性保護劑時，在相同條件下凍干，發(fā)現(xiàn)該凍干樣品中胰島素效價減少量僅為0.14～1.80 IU／mL，說明在LEAM中加入一定量的海藻糖后，能更好保護胰島素的生物活性。因此，LEAM和海藻糖對凍干過程中的胰島素起協(xié)同保護作用。當LEAM和海藻糖復(fù)合保護的凍干樣品中胰島素和海藻糖質(zhì)量比為1：1時，凍干樣品中胰島素效價減少量隨著LEAM加入量的增大而減小，即隨著LEAM加入量的增大，凍干保護效果更優(yōu)。胰島素和LEAM的比例為1：5時，凍干保護效果達到相對最佳。

第4組復(fù)合保護的凍干樣品組中的海藻糖的質(zhì)量比提高1倍。凍干效價減少量表明胰島素和LEAM質(zhì)量比為1：1和1：3時的凍干樣品的胰島素效價減少量均比第3組復(fù)合保護的凍干樣品效價減少量??；當胰島素和LEAM質(zhì)量比提高到1：5和1：7時，復(fù)合保護凍干樣品的效價減少量又均比第3組胰島素凍干樣品的效價減少量大，但依然比前兩組的保護效果好。這說明加入少量海藻糖對提升胰島素和LEAM的協(xié)同保護效果更好。因為大量海藻糖的存在可能會影響LEAM在胰島素蛋白表面的吸附作用，導(dǎo)致LEAM吸附保護作用減弱。

根據(jù)水替代假說［15］，在干燥過程中，隨著水分子的缺失，高親水性的LEAM會穩(wěn)定吸附在胰島素蛋白表面，形成保護層，保護胰島素不因缺水而受到傷害。但因分子較大，不能完全占據(jù)整個胰島蛋白分子表面，加入海藻糖后，小分子的海藻糖可以有效彌補這種缺陷，在胰島素表面協(xié)同作用，有效形成一種復(fù)合保護層。當海藻糖數(shù)量較多時，胰島蛋白表面大部分被海藻糖占據(jù)，盡管海藻糖不易結(jié)晶，而是形成玻璃態(tài)，也有保護作用［16］，但是LEAM被逐漸隔離開來，故保護效果又有明顯下降。

2.3 凍干樣品的DSC熱分析

藥物凍干后，原來的水溶劑環(huán)境消失，溶劑化穩(wěn)定作用也消失，干燥的無水環(huán)境打破了蛋白質(zhì)表面基團間作用力的平衡，藥物活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性逐漸變差。而加入保護劑后，保護劑在藥物蛋白表面的吸附作用，可以部分替代水溶劑環(huán)境，維持蛋白質(zhì)活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。為了研究不同保護劑及其配比對胰島素蛋白的穩(wěn)定作用，本文利用差示掃描量熱儀，測定凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、熱焓松弛峰溫和熱焓松弛焓值，分析各保護劑對蛋白藥物的保護效果及整體熱穩(wěn)定性。

圖4（a）所示為胰島素的DSC曲線、圖4（b）所示為LEAM保護劑的DSC曲線、圖4（c）所示為海藻糖保護劑的DSC曲線。觀察圖4（c）發(fā)現(xiàn)，海藻糖的DSC曲線，在98.47℃有一個明顯的吸熱峰，同時文獻［17］中指出二水海藻糖的熔融溫度為97℃，該吸熱峰溫度與文獻中所列溫度較一致，故本實驗所用海藻糖的熔融峰的峰溫為98.47℃±0.59℃。而除圖4（c）外，其它樣品的DSC曲線的玻璃化轉(zhuǎn)變區(qū)域的高溫側(cè)均有一個吸熱峰，這是由于結(jié)構(gòu)松弛引起的焓恢復(fù)過程，即從高能非平衡玻璃態(tài)向平衡態(tài)松弛的過程，故胰島素干粉和LEAM干粉發(fā)生了伴隨熱焓松弛的玻璃化轉(zhuǎn)變。同時，進一步觀察加入不同劑量配比保護劑后凍干樣品的DSC曲線（圖5）發(fā)現(xiàn)，加有保護劑的凍干樣品也均發(fā)生伴隨熱焓松弛的玻璃化轉(zhuǎn)變。

表3所示為不同保護劑含量下凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、熱焓松弛峰溫和熱焓值。分析表3中的數(shù)據(jù)可知，第1組實驗中，當LEAM作為保護劑時，且胰島素和LEAM的質(zhì)量比為1：1時，該凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度比胰島素干粉的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度僅高出0.53℃，同時該凍干樣品的熱焓松弛峰溫低于胰島素干粉的熱焓松弛峰溫，說明單純加入較低劑量LEAM保護劑對凍干樣品熱穩(wěn)定性的提升影響較小，凍干樣品熱穩(wěn)定性仍較差，較易發(fā)生分解。但隨著LEAM加入量的增大，凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和熱焓松弛峰溫均隨著LEAM的增加而增大，說明隨著LEAM的增加，凍干樣品在更高溫度發(fā)生相變，熱穩(wěn)定性得到提高。文獻［18］中指出10%和20%的海藻糖溶液凍干品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分別為35.3℃和36.6℃。而LEAM粉末的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為134.58℃，LEAM粉末的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度遠遠高于海藻糖凍干品。因此，第1組LEAM保護的胰島素凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和熱焓松弛峰溫均高于第2組海藻糖保護的胰島素凍干樣品，說明LEAM保護效果更好，可更大程度上提升凍干樣品的熱穩(wěn)定性。

在第3組兩種保護劑復(fù)合保護胰島素的DSC實驗中，復(fù)合保護的凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度分別較第1組凍干樣品提升1.31℃、0.3℃、0.09℃和8.11℃。第4組復(fù)合保護胰島素凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（除第4組第1個凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低外）分別比第1組凍干樣品提升0.53℃、2.87℃和8.83℃。說明除胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2的凍干樣品外，兩種保護劑協(xié)同作用后，對凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度均有提升，即協(xié)同保護的凍干樣品的熱穩(wěn)定性提升。

第3組和第4組凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，均隨著LEAM和海藻糖加入量的增大而增大。觀察所有兩組凍干樣品的熱焓松弛峰溫，發(fā)現(xiàn)兩種保護劑協(xié)同作用后的所有凍干樣品（除胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2凍干樣品外）的熱焓松弛峰溫均比第1組LEAM保護的凍干樣品低。原因可能是由于海藻糖在98.47℃附近即發(fā)生熔融，故復(fù)合保護的凍干樣品的熱焓松弛峰溫均比第1組LEAM保護的凍干樣品低。

比較復(fù)合保護的凍干樣品和第1組凍干樣品的熱焓松弛焓值，發(fā)現(xiàn)除胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2的凍干樣品外，其余復(fù)合保護的凍干樣品的熱焓松弛焓值均低于相應(yīng)的第1組凍干樣品的熱焓松弛焓值，且隨著海藻糖的增加，凍干樣品的熱焓松弛焓值降低。這說明LEAM和少量海藻糖協(xié)同保護的凍干樣品，較相應(yīng)的LEAM保護胰島素凍干樣品而言，更難發(fā)生從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)晶態(tài)的焓松弛。其原因可能是干燥誘導(dǎo)LEAM較好地貼合在胰島素蛋白的外面，穩(wěn)固了胰島素蛋白的穩(wěn)定性，而加入少量海藻糖后，提升了玻璃體的強度，從而提升凍干樣品的熱穩(wěn)定性。

表3 不同保護劑含量下凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，熱焓松弛峰溫和熱焓松弛焓值Tab.3 Variation of Tg，Tmaxand ΔH of lyophilized products with different mass of protectant

圖4 胰島素及LEAM、海藻糖保護劑的DSC曲線Fig.4 DSC curves of insulin and protectant LEAM and trehalose

而當胰島素、LEAM和海藻糖的質(zhì)量比為1：1：2時，該凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較單一胰島素的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低，該樣品的DSC曲線的峰型與第2組海藻糖保護的胰島素凍干樣品的DSC曲線峰型具有較高一致性，其原因可能是由于該凍干樣品中海藻糖含量較高，而海藻糖凍干品具有較低的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，該體系的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較低。

3 結(jié)論

本研究分別利用高效液相色譜測定胰島素效價和差示掃描量熱儀測定凍干樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度等方法，以研究LEAM和海藻糖及其二者協(xié)同作用對熱敏性蛋白藥物胰島素的凍干保護效果和熱穩(wěn)定性的影響。

圖5 LEAM和海藻糖分別保護的凍干樣品及LEAM和海藻糖協(xié)同保護凍干樣品DSC曲線圖Fig.5 DSC curves of lyophilized insulin?LEAM，insulin?trehalose and synergistic LEAM and trehalose with insulin products

LEAM或海藻糖均對熱敏性蛋白藥物胰島素具有一定保護效果，且LEAM的保護效果優(yōu)于海藻糖。LEAM保護的胰島素凍干樣品的熱穩(wěn)定性也高于海藻糖保護的胰島素凍干樣品。因此，LEAM是一種優(yōu)良的凍干活性保護劑。

兩種保護劑復(fù)合保護時，少量海藻糖對于LEAM的保護特性具有協(xié)同增效的作用，但隨著海藻糖的增加，對凍干協(xié)同保護效果的提升不明顯。DSC測定結(jié)果則顯示，兩種保護劑協(xié)同作用不僅可有效提高凍干樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，還提升了凍干樣品的玻璃體強度，增加了凍干樣品的熱穩(wěn)定性。

兩種保護劑復(fù)合保護時，最佳的配比是胰島素?LEAM?海藻糖質(zhì)量比為1：1：2～1：3：2。

本文受上海市“創(chuàng)新行動計劃”國際科技合作項目（12430702000），上海市重點學(xué)科項目（T0503和 P0502），上海市自然科學(xué)基金（12ZR1420400），上海市教委科研創(chuàng)新項目（14YZ092）和上海市聯(lián)盟計劃項目資助。（The project was supported by the Innovation Foundation for International Coopera?tion of the Shanghai Committee of Science and Technology（No. 12430702000），Key Disciplines Program of Shanghai（No.T0503 ＆No.P0502），the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 12ZR1420400），Innovation Program of Shanghai Municipal Edu?cation Commission（No.14YZ092）and Alliance Program in Shanghai.）

［1］ Reaven G M.Role of insulin resistance in human disease ［J］.Diabetes，1988，37（12）：1595?1607.

［2］ Alexander H I.Inhaled insulins：their potential in the treat?ment of diabetes mellitus［J］.Treat Endocrinol，2005，4 （3）：131?138.

［3］ White J R，Campbell R K.Inhaled insulin：an overview ［J］.Clin Diabetes，2001，19：13?16.

［4］ 武華麗，胡一橋.冷凍干燥制劑的穩(wěn)定性研究進展［J］.中國藥學(xué)雜志，2001，36（7）：436?438.（Wu Hua?li，Hu Yiqiao.Research on the stability of lyophilized product［J］.Chinese Pharmaceutical Journal，2001，36（7）：436?438.）

［5］ Dure III L，Greenway S C，Galau G A.Developmental bi?ochemistry of cottonseed embryogenesis and germination：changing messenger ribonucleic acid populations as shown by in vitro and in vivo protein synthesis［J］.Biochemistry，1981，20（14）：4162?4168.

［6］ Menze M A，Hand S C.How do animal mitochondria toler?ate water stress？［J］.Commun Integr Biol，2009，2（5）：428?430.

［7］ Tunnacliffe A，Wise M J.The continuing conundrum of the LEA proteins［J］.Naturwissenschaften，2007，94（10）：791?812.

［8］ Menze M A，Boswell L，Toner M，et al.Occurrence of mitochondria?targeted late embryogenesis abundant（LEA）gene in animals increases organelle resistance to water stress［J］.Journal of Biological Chemistry，2009，284 （16）：10714?10719.

［9］ Boudet J，Buitink J，Hoekstra F A，et al.Comparative a?nalysis of the heat stable proteome of radicles of Medicago truncatula seeds during germination identifies late embryo?genesis abundant proteins associated with desiccation toler?ance［J］.Plant Physiology，2006，140（4）：1418?1436.

［10］Dure L.A repeating 11?mer amino acid motif and plant desiccation［J］.The Plant Journal，1993，3（3）：363?369.

［11］Li Daixi，He Xiaoming.Desiccation induced structural al?terations in a 66?amino acid fragment of an anhydrobiotic nematode late embryogenesis abundant（LEA）protein［J］. Biomacromolecules，2009，10（6）：1469?1477.

［12］Fisher B V，Smith D.HPLC as a replacement for the ani?mal response assays for insulin［J］.Journal of Pharmaceu?tical and Biomedical Analysis，1986，4（3）：377?387.

［13］Pikal M J，Rigsbee D R.The stability of insulin in crystal?line and amorphous solids：observation of greater stability for the amorphous form［J］.Pharmaceutical Research，1997，14（10）：1379?1387.

［14］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：845?846.

［15］華澤釗.冷凍干燥新技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2006：200?202.

［16］Crowe J H，Crowe L M，Carpenter J F，et al.Stabilization of dry phospholipid bilayers and proteins by sugars［J］.Bi?ochemical Journal，1987，242（1）：1?10.

［17］Jain N K，Roy I.Effect of trehalose on protein structure ［J］.Protein Science，2009，18（1）：24?36.

［18］周新麗，劉建峰，張紹志，等.生物材料凍干保護劑的熱分析［J］.制冷學(xué)報，2008，29（5）：54?57.（Zhou Xinli，Liu Jianfeng，Zhang Shaozhi，et al.Thermal analy?sis on lyoprotectants for biomaterials［J］.Journal of Refrig?eration，2008，29（5）：54?57.）

李代禧，男，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，（021）55271117，E?mail：dxli75＠126.com。研究方向：計算生物學(xué)和低溫生物熱科學(xué)?，F(xiàn)在進行的研究項目：國家自然科學(xué)基金（51076108），上海市＂創(chuàng)新行動計劃＂國際科技合作項目（12430702000），上海市重點學(xué)科項目（T0503和P0502），上海市自然科學(xué)基金（12ZR1420400），上海市教委科研創(chuàng)新項目（14YZ092）和上海市聯(lián)盟計劃項目。

About the corresponding author

Li Daixi，male，Ph.D.，master instructor，associate professor，Institue of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 21－55271117，E?mail：dxli75＠126.com.Research fields：computational biology and cryobiology thermal science.The author takes on project sup?ported by the National Natural Science Fundation of China（No. 51076108），the Innovation Foundation for International Coopera?tion of the Shanghai Committee of Science and Technology（No. 12430702000），Key Disciplines Program of Shanghai（No.T0503 ＆No.P0502），the Natural Science Foundation of Shanghai（No. 12ZR1420400），Innovation Program of Shanghai Municipal Edu?cation Commission（No.14YZ092）and Alliance Program in Shanghai.

Synergistic Bioactive Protection of LEA?motif and Trehalose on Insulin during Freeze?drying

Liu Li1Li Daixi1Guo Baisong2Pan Qi1Yu Huaxing1Chai Pei1Liu Baolin1Yang Chunsheng2

（1.Institute of Biothermal Science and Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China；2.Shanghai Tofflon Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai，201108，China）

Water Due to the poor heat stability，insulin is easy to lose its bioactivity during storage.Bioactive protection of LEA?motif（LEAM）and trehalose towards insulin was investigated respectively and synergistically.High performance liquid chromatography method was used to study the proficiency of insulin and differential scanning calorimetry was used to study glass transition temperature.According to the re?sults，both LEAM and trehalose can protect the bioactivity of insulin.The protective effect of LEAM is better than that of trehalose.That is to say that the bioactivity proficiency and heat stability of insulin within LEAM are better than those of insulin within trehalose.It is in?teresting that adding a bit trehalose can enhance the bioactive protection effect of LEAM towards insulin.During lyophilization，synergistic bioactive protection of LEAM and trehalose can not only enhance the stability of insulin，but also protect insulin from thermal degenera?tion.So such synergistic bioprotectants can be used to maintain the bioactivity of heat sensitive protein during lyophilization.

LEA?motif；insulin；trehalose；lyophilization；protectant

R318.52；TQ025.3

A

0253－4339（2015）04－0111－08

10.3969／j.issn.0253－4339.2015.04.111

簡介

國家自然科學(xué)基金（51076108）資助項目。（The project was supported by the National Natural Science Fundation of China（No. 51076108）.）

2014年12月8日