綜合康復(fù)對大鼠受壓坐骨神經(jīng)微血管生成的影響

陳峰 杜震生 曹惠萍 艾名洋 趙一強(qiáng) 宋維永518105廣東省深圳市松崗人民醫(yī)院

綜合康復(fù)對大鼠受壓坐骨神經(jīng)微血管生成的影響

陳峰 杜震生 曹惠萍 艾名洋 趙一強(qiáng) 宋維永
518105廣東省深圳市松崗人民醫(yī)院

目的：探討康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法對大鼠卡壓坐骨神經(jīng)微血管生成的影響。方法：造模成功的雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組。取大鼠卡壓神經(jīng)中段標(biāo)本石蠟切片進(jìn)行CD34、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）免疫組化染色，觀察神經(jīng)微血管密度（MVD）及VEGF表達(dá)。結(jié)果：B、C、D組MVD及VEGF表達(dá)均高于A組（P＜0.05）。D組MVD及VEGF表達(dá)均高于B組和C組（P＜0.05）。結(jié)論：康復(fù)訓(xùn)練及針刺療法對大鼠受卡壓坐骨神經(jīng)微血管生成有促進(jìn)作用，二者聯(lián)合運(yùn)用，效果更優(yōu)。

康復(fù)訓(xùn)練；針刺療法；坐骨神經(jīng)；神經(jīng)微血管生成；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

周圍神經(jīng)卡壓是手足外科常見、多發(fā)的損傷。精湛的顯微外科技術(shù)能精確地解除卡壓，然而，周圍神經(jīng)受壓后，如何防止壓迫性神經(jīng)傳導(dǎo)功能受損，恢復(fù)周圍神經(jīng)的傳導(dǎo)功能，仍是當(dāng)前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。穩(wěn)定的微循環(huán)可保證周圍神經(jīng)的正常傳導(dǎo)功能，神經(jīng)再生、功能恢復(fù)的關(guān)鍵是神經(jīng)微血管的生成［1,2］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法對大鼠卡壓坐骨神經(jīng)微血管生成的影響，探討其可能的意義。

資料與方法

主要試劑和動(dòng)物分組：小鼠抗大鼠VEGF單抗、SABC免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠CD34多克隆抗體、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供。其他試劑均為國產(chǎn)AR級(jí)。選用雄性SD大鼠40只（廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量230～250 g。所有大鼠均在同一條件溫室飼養(yǎng)，光照12 h/d，自由進(jìn)食、飲水。造模成功后的雄性SD大鼠40只簡單隨機(jī)化摸球法等分為4組：A組（對照組）：僅祛除卡壓；B組（康復(fù)訓(xùn)練組）：祛除卡壓后行康復(fù)訓(xùn)練；C組（針刺組）：祛除卡壓后行電針治療；D組（康復(fù)訓(xùn)練+針刺組）：祛除卡壓后行康復(fù)訓(xùn)練加電針治療。

大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型的建立及各組處理：①動(dòng)物模型制作：動(dòng)物模型參照經(jīng)典Mackinnon大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型制作［3］。模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于同一動(dòng)物飼養(yǎng)室適宜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)前8 h禁食水，常規(guī)麻醉、手術(shù)，制作坐骨神經(jīng)卡壓模型。②康復(fù)訓(xùn)練［4］：祛除卡壓術(shù)后第2周開始游泳訓(xùn)練，1次/d，第1天10min，逐日增加3min，術(shù)后第3周開始每天游泳30min，直到術(shù)后第3周結(jié)束取材為止。③電針治療［5］：穴位電針刺激于祛除卡壓術(shù)后第2天開始，在特別的支架上固定，按實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)進(jìn)行穴位定位，電針正極接在近心端，負(fù)極接在遠(yuǎn)心端。分別夾在“足三里”和“環(huán)跳”穴處的針柄上。具體操作嚴(yán)格按文獻(xiàn)進(jìn)行，直到術(shù)后第3周結(jié)束取材為止。

CD34免疫組化染色及MVD測定［6］：取卡壓神經(jīng)中段標(biāo)本石蠟切片，進(jìn)行CD34免疫組化染色（具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行）。光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)微血管密度（MVD）：CD34陽性染色微血管呈棕黃色至深棕色。參照Weidner微血管計(jì)數(shù)方法［7］，呈現(xiàn)棕色內(nèi)皮細(xì)胞群或單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞記為一個(gè)血管，選擇染色切片的血管密集區(qū)，在200倍視野下選5個(gè)再生神經(jīng)視野，計(jì)數(shù)其中微血管量，求其平均值。

VEGF表達(dá)檢測：取卡壓神經(jīng)中段標(biāo)本石蠟切片，采用免疫組化染色（具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行）。利用德國Simple PCI圖像分析系統(tǒng)測量灰度，將免疫組化染色結(jié)果轉(zhuǎn)化為灰度值進(jìn)行定量分析。陽性細(xì)胞著色部位為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，顏色為棕黃色。每張切片以組織間質(zhì)空白處入射光的值為定標(biāo)，每張切片選取5個(gè)視野（200倍），測定灰度值，取其平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：錄入SPSS 19.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，兩組均數(shù)比較，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

與A組比較，B、C、D組MVD含量均高于A組（P＜0.05）；與B、C組分別比較，D組MVD含量均高于B組和C組（P＜0.05）。大鼠坐骨神經(jīng)微血管密度的測定，見表1、圖1。

與A組比較，B、C、D組VEGF表達(dá)均高于A組（P＜0.05）；與B、C組分別比較，D組VEGF表達(dá)均高于B組和C組（P＜0.05）。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，見表1、圖2。

討論

周圍神經(jīng)卡壓是因?yàn)槠涮囟ú课皇軌汉髮?dǎo)致其傳導(dǎo)功能受損的疾病，是手足外科常見疾病之一。神經(jīng)卡壓導(dǎo)致其微循環(huán)改變，引起不同程度的感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙，其機(jī)制［8,9］：①周圍神經(jīng)微循環(huán)障礙和機(jī)械性損傷導(dǎo)致其固有結(jié)構(gòu)受損。②周圍神經(jīng)的血液供應(yīng)主要來自于其周圍的肌肉和筋膜，而周圍肌肉的萎縮和筋膜的受損導(dǎo)致卡壓神經(jīng)缺血、缺氧。③周圍神經(jīng)的血液供應(yīng)是其再生的決定性因素，但卡壓神經(jīng)出現(xiàn)的炎性反應(yīng)增加了耗氧量，從而加重了卡壓神經(jīng)的缺氧。④神經(jīng)損傷后MVD下降，血管數(shù)量減少以及血管通透性的增加，都是導(dǎo)致卡壓神經(jīng)缺血、缺氧的重要因素。Weerasriya通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)受損后其微循環(huán)中血管通透性達(dá)最高蜂的時(shí)間3 h［10］。Podhajsky發(fā)現(xiàn)損傷神經(jīng)早期血管半徑和周長增加［11］，而血管數(shù)量減少，神經(jīng)修復(fù)期血管數(shù)量和密度增加，而血管數(shù)量增加促進(jìn)受損神經(jīng)再生。

楊米雄等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)主動(dòng)運(yùn)動(dòng)可以明顯改善大鼠卡壓后坐骨神經(jīng)的傳導(dǎo)功能和促進(jìn)其再生［12-13］。張立寧等認(rèn)為電針可促進(jìn)受損神經(jīng)再生［14］。但對康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法的綜合康復(fù)促進(jìn)神經(jīng)血管再生的實(shí)驗(yàn)研究較少。

神經(jīng)再生過程中其微循環(huán)中血管生成是主要的因素，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）又是血管生成的決定性因素［15］。 CD34是跨膜細(xì)胞表面糖蛋白，是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，故常用其標(biāo)記新生血管［16-17］。

表1 大鼠坐骨神經(jīng)MVD含量及VEGF表達(dá)的變化（x±s）

圖1 大鼠受壓坐骨神經(jīng)各組CD34免疫組化染色（×200）

圖2 大鼠受壓坐骨神經(jīng)VEGF在各組的表達(dá)（×200）

本研究采用康復(fù)訓(xùn)練和針刺療法治療周圍神經(jīng)卡壓，觀察該2種療法是否促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，探討其對于神經(jīng)微血管生成和功能恢復(fù)的影響，為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供一些新的思路。在本實(shí)驗(yàn)中，與A組比較，B、C、D組MVD含量及VEGF表達(dá)均高于A組（P＜0.05）；與B、C組分別比較，D組MVD含量及VEGF表達(dá)均高于B組和C組（P＜0.05）。說明康復(fù)訓(xùn)練和針刺療法均能促進(jìn)受損傷大鼠坐骨神經(jīng)微血管生成，且二者聯(lián)合效果更明顯，從而證實(shí)了康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法的綜合康復(fù)能促進(jìn)受卡壓大鼠坐骨神經(jīng)再生修復(fù)，對神經(jīng)功能的修復(fù)有積極的影響，為臨床從神經(jīng)微循環(huán)角度治療神經(jīng)損傷提供了理論依據(jù)。

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Influence of com prehensive rehabilitation on them icrovascular generation of com pressed sciatic nerve in rat

Chen Feng,Du Zhensheng,Cao Huiping,AiMingyang,Zhao Yiqiang,SongWeiyong Songgang People'sHospitalofShenzhen City,Guangdong Province 518105

Objective：To explore the influence of rehabilitation training combined acupuncture therapy on the microvascular generation of compressed sciatic nerve in rat.Methods：40 cases ofmale SD ratswith successfulmodeling were random ly divided into four groups.The paraffin section ofmiddle specimen from compressed nerve in ratwere given immunohistochemical staining for CD34,vascular endothelialgrowth factor（VEGF）,the nervemicrovascular density（MVD）and VEGF expression were observed. Results：TheMVD and VEGF expression of the group B,group C,group Dwere higher than thatof the group A（P＜0.05）.The MVD and VEGF expression of the group D were higher than that of the group B and group C（P＜0.05）.Conclusion：Rehabilitation training and acupuncture therapy had promoting effecton themicrovascular generation of compressed sciatic nerve in rat,and the both jointhad bettereffect.

Rehabilitation training；Acupuncture therapy；Sciatic nerve；Nerve microvascular generation；Vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.24.1