Real—TimePCR方法對IBV弱毒苗致弱分析

霍亞飛+胡北俠+張秀美+張琳+楊少華+黃慶華+黃艷艷+許傳田

摘要：在前期研究中，對QX基因型IBV分離株SDZB0808在SPF雞胚連續(xù)傳代前后毒株（P1和P100）進(jìn)行全基因組測序。針對P1和P100毒株基因組的差異，設(shè)計特異性引物，利用SYBRGreenI實時熒光定量檢測方法對其進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示：該野毒株強、弱基因并存，經(jīng)雞胚傳代后，強毒毒株所占比例逐步下降，弱毒毒株所占比例逐步上升，相對值呈下降趨勢，接近于零。從而推測：傳染性支氣管炎病毒致弱原因可能是雞胚對弱毒基因的定向選擇性篩選的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎；Real-TimePCR；IBV弱毒苗；致弱

中圖分類號：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2015）04-0112-05

雞傳染性支氣管炎（AvianInfectiousBronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一類急性、高度接觸性并以感染呼吸道和泌尿生殖道為主的傳染病[1]。IBV為冠狀病毒，5'端為復(fù)制酶引導(dǎo)序列形成的帽子結(jié)構(gòu)，3'端為聚腺苷酸化的Poly（A）結(jié)構(gòu)，全長27.6kb。IBV基因組被分成6個區(qū)域，從5'端到3'端次序為：5'cap-Replicase-S-3a-3b-M-Sa-5b-Npoly（A）3'，利用不連續(xù)復(fù)制機制轉(zhuǎn)錄出6種亞單位組mRNAs，其中5'端2/3的基因組編碼具有活性的復(fù)制酶，包含兩個開放性閱讀框（Openingreadingframe，ORF）ORF1a和1b，3'端1/3的基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白-纖突蛋白（Spike，S）、膜蛋白（Membrane，M）、核蛋白（Nucleocapsid，N）和囊膜蛋白（Envelope，E）[2-3]。

收稿日期：2014-12-18

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-42-712）

目前，疫苗免疫是傳染性支氣管炎防控的主要手段之一。本實驗室篩選了1株具有廣泛抗原譜的QX基因型IBV毒株SDZB0808[4]，并通過雞胚連續(xù)傳代進(jìn)行毒力致弱，通過對不同代次的病毒進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)傳代到62代時，復(fù)制酶1a序列上缺失30bp位點（另文報道），之后的代次一直保持這種缺失狀態(tài)。本研究采用SYBRGreenI實時熒光定量檢測方法對不同代次的病毒進(jìn)行檢測，對不同代次病毒基因組進(jìn)行定量分析，探討不同代次強、弱毒株所占比例的變化規(guī)律，以期闡明傳染性支氣管炎弱毒株致弱機理。

1材料與方法

1.1病毒

SDZB0808（GenBank登錄號為KF853202）為山東IBV分離株。

P1、P60、P100（GenBank登錄號為KM586818）、P110為SDZB0808在9～11日齡SPF雞胚分別連續(xù)傳1、60、100、110代獲得的子代病毒。

1.2SPF雞胚和SPF雞

SPF雞胚和SPF雞購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心。

1.3主要試劑

TaqDNA聚合酶、TrizolReagentRNA抽提試劑、One-StepRT-PCR試劑盒和pMD?18-TVector均購自山東賽恩斯科技有限公司。柱式DNA膠回收試劑盒（SK8131）、一步法快速感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（SK9307）、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（SK8191）、定量PCR試劑ABISYBRGreenPCRMasterMix（2X）均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.4引物的設(shè)計與合成

參與P1和P100全基因組序列，后者比前者缺失30bp位點，為了能更好地區(qū)分這兩個序列，暫把未存在缺失的序列稱為強毒毒株（QD），存在缺失的序列為弱毒毒株（RD），并把弱毒毒株基因作為內(nèi)參照，針對缺失部分設(shè)計特異性引物，其中缺失部分為QD的上游引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.5.1RNA提取與PCR擴增按照TrizolReagentRNA抽提試劑方法提取RNA，轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（25μL）為：模板cDNA0.5μL，上下游引物各0.5μL，dNTP（10mmol）0.5μL，TaqBuffer（10×）2.5μL，MgCl2（25mmol）2μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，H2O18.3μL。兩個基因擴增條件均為：95℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃修復(fù)延伸8min。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對鑒定正確的目的條帶用手術(shù)刀切下，按DNA回收試劑盒步驟進(jìn)行回收，將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體于4℃連接過夜，連接反應(yīng)體系為：Solution5μL，pMD18-TVrctor10ng，PCRProduct5μLL。將連接產(chǎn)物加入到50μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后，42℃熱激45s，再冰浴15min，向其中加入600μLSOC培養(yǎng)基，37℃200～250r/min振蕩培養(yǎng)1h，取100μL加入預(yù)先用100mmolIPTG20μL和20mg/mLX-gal100μL涂布的氨芐青霉素平板上，置37℃溫箱培養(yǎng)12～24h，挑取白色單菌落擴大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定為陽性的菌液用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測序。

將陽性重組質(zhì)粒分別命名為pMD18-QD、pMD18-RD，用紫外分光光度計測定其在260nm處的吸光度及濃度（ng/μL），并進(jìn)行10倍遞增稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，用于熒光定量PCR的擴增和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。質(zhì)粒濃度（copies/μL）=260nm處對應(yīng)濃度（ng/μL）×6.02×1014/分子量。endprint

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以10倍梯度稀釋的已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量檢測，Real-TimePCR反應(yīng)體系（20μL）：SBRYGreenqPCRMasterMix（2x）10μL，上下游引物（10μmol）各1μL，ddH2O6μL，cDNA2μL。循環(huán)條件為：95℃3min，95℃15s，57℃20s，72℃30s，40個循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR電泳結(jié)果

2%瓊脂糖凝膠，1×TAE，150V，100mA，20min電泳觀察（見圖1）。

2.2標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒OD260值測定結(jié)果

對構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質(zhì)粒OD260值，通過公式換算可知，QD基因和RD基因的拷貝數(shù)分別為8.16×108copies/μL、7.45×108Copies/μL（表2）。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取10倍梯度稀釋的QD基因和RD基因重組質(zhì)粒pMD18-QD、pMD18-RD標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增，建立以目的基因拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)、Ct值（循環(huán)閾值）為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2-1和2-2），QD基因標(biāo)準(zhǔn)曲線表達(dá)式為：y=-3.162x+38.905，RD基因標(biāo)準(zhǔn)曲線表達(dá)式為y=-3.271x+38.933。QD基因與RD基因?qū)崟r熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均達(dá)到5個數(shù)量級，各重組質(zhì)粒濃度分別在8.16×104～8.16×108和7.45×104～7.45×108copies/μL之間，得到擴增動力學(xué)曲線（圖3-1、3-2），其對數(shù)與相應(yīng)Ct值均具有良好的相關(guān)性，決定系數(shù)（R2）分別為0.996與0.993。

2.4特異性檢測

QD基因與RD基因SYBRGreenI實時熒光定量PCR產(chǎn)物的特異性很強，兩基因特異產(chǎn)物的熔解峰分別為80.46℃與80.74℃，熔解曲線均為單一峰值（圖4-1、4-2）。

2.5不同代次定量分析結(jié)果

Real-TimePCR檢測結(jié)果顯示：隨著傳代次數(shù)的遞增，強毒毒株所占比例逐漸減少，而弱毒毒株所占比例逐步增加，兩者相對值逐步下降，到P110，相對值基本為0。

3結(jié)論與討論

IB弱毒苗是由IB分離株在雞胚連續(xù)傳代獲得的，H120、MA5和2886等多種IB弱毒活疫苗用于該病的免疫預(yù)防[5，6]，但這種由強毒變?yōu)槿醵镜闹氯鯔C理目前還不明確。本實驗室在前期研究的基礎(chǔ)上，對不同代次毒株進(jìn)行Real-timePCR檢測，結(jié)果顯示：在雞胚傳代過程中，強毒株所占比例隨代次增加而減少，而弱毒株所占比例恰恰相反。由此可以推測，此弱毒疫苗是由強毒毒株與弱毒毒株組成的“準(zhǔn)種”（QuasisPecies），在雞胚連續(xù)傳代過程中，雞胚對弱毒毒株進(jìn)行定向篩選，弱毒株逐漸成為優(yōu)勢毒株，這種推測與之前學(xué)者的報道一致[7～10]，即病毒致弱可能是毒株被選擇性篩選的結(jié)果。

下一步將繼續(xù)傳代并檢測強毒毒株與弱毒毒株所占比例的變化情況，并且挑選不同代次進(jìn)行安全性與免疫效力評價，以期尋找到合適的代次用于疫苗的研發(fā)。endprint