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    山東葡萄霜霉病菌致病力分化及親緣關(guān)系研究

    2015-12-22 19:17張眉辛相啟吳斌王升吉郭霞趙玖華
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:山東

    張眉+辛相啟+吳斌+王升吉+郭霞+趙玖華

    摘要:為明確山東地區(qū)葡萄霜霉病菌株的致病性及親緣關(guān)系,本研究以不同抗性的6個(gè)葡萄品種作為鑒別寄主,采用葉盤接種法,對(duì)采自山東地區(qū)的13個(gè)葡萄霜霉病菌株進(jìn)行致病性測定,并擴(kuò)增每個(gè)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明,這13個(gè)葡萄霜霉病菌株均有致病性,據(jù)致病力分為強(qiáng)、中、弱3種致病類型,中等致病型菌株占優(yōu)勢,菌株間致病力差異與菌株的地域來源無明顯相關(guān)性序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,這13個(gè)葡萄霜霉病菌株的親緣關(guān)系很近,rDNA-ITS序列同源性高達(dá)99.94%,菌株間致病力差異與rDNA-ITS序列多態(tài)性不相關(guān)。

    關(guān)鍵詞:葡萄霜霉病菌;致病力分化;rDNA-ITS;親緣關(guān)系;山東

    中圖分類號(hào):S436.631.1+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2015)04-0095-05

    葡萄霜霉病是一種世界性病害,在我國已遍布各葡萄產(chǎn)區(qū),可導(dǎo)致年減產(chǎn)30%~50%[1]。葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(Berk.&Curt.)Berl.&deToni]的致病力是否存在分化在國內(nèi)外的研究中一直存有分歧。劉旭等[2]研究表明來自重慶和陜西2個(gè)地區(qū)的葡萄霜霉病菌致病力沒有顯著差異;Boubals[3]卻發(fā)現(xiàn)不同來源的葡萄霜霉病菌可以表現(xiàn)出不同的致病力。目前由東葡萄霜霉病菌的致病力分化研究還未曾有報(bào)道,因此,本研究將采自山東地區(qū)13個(gè)不同霜霉病菌株接種于6個(gè)不同抗性葡萄品種進(jìn)行致病性測定,以明確葡萄霜霉病菌的致病性特點(diǎn),為該病菌的致病機(jī)制及病害流行規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

    收稿日期:2014-12-01

    基金項(xiàng)目:公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203035)

    核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspace,ITS)因在真核生物種內(nèi)相對(duì)保守,種間差異顯著,常用于真菌物種的分類鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。賈姝等[4]利用rDNA-ITS序列分析發(fā)現(xiàn),遼寧地區(qū)不同葡萄霜霉病菌株間具有一定的遺傳分化;張勝菊等[5]分析了大白菜與甘藍(lán)寄生霜霉菌的rDNA-ITS序列,表明兩者均與甘藍(lán)型油菜霜霉病菌有較近的親緣關(guān)系。本研究從分子水平上對(duì)山東不同葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行比較分析,對(duì)探明該病菌的親緣關(guān)系等遺傳進(jìn)化研究有重要意義。

    1材料與方法

    1.1供試材料

    在山東地區(qū)采集的13個(gè)不同葡萄霜霉病菌株,見表1。

    供試鑒別寄主為6個(gè)不同抗性的葡萄品種,分別是摩爾多瓦、夏黑、赤霞珠、玫瑰香、貴妃玫瑰和紅提。

    1.2生化試劑及其他

    EasyTaq酶購自北京全式金公司,DNA凝膠回收試劑盒購自上海Sangon,其他常規(guī)化學(xué)藥品為分析純?cè)噭?。PCR引物合成和DNA測序均由上海Sangon完成。

    1.3葡萄霜霉病菌的室內(nèi)接種

    1.3.1接種物與寄主植物的準(zhǔn)備從田間采集新鮮的葡萄霜霉病葉,在流水下用毛筆刷掉病斑上老的霉層,將病葉放于人工氣候培養(yǎng)箱中,22℃、相對(duì)濕度(RH)90%、光照黑暗各12h交替培養(yǎng),待長出新的白色霉層時(shí),取孢子囊梗及孢子囊至無菌水中,充分吸打后,將孢子囊懸浮液濃度稀釋至1×105個(gè)/mL,用于接種。

    選取葡萄當(dāng)年生枝條自上向下第3~4節(jié)位健康無病葉片,清水洗凈后,用內(nèi)徑15mm的打孔器打取葉盤。在直徑90mm培養(yǎng)皿底鋪1層濾紙,加入2mL無菌水,將葉盤葉背朝上放入培養(yǎng)皿中,每皿隨機(jī)放入10個(gè)葉盤作為1個(gè)重復(fù),每個(gè)菌株每個(gè)寄主品種重復(fù)3次。

    1.3.2接種及病情調(diào)查采用葉盤接種法接種。用微量移液器吸取稀釋好的孢子囊懸浮液滴加在葉盤中央,每個(gè)葉盤接種20μL。清水作對(duì)照。接種后,將培養(yǎng)皿放于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi),22℃、RH90%、光照黑暗各12h交替培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后,用吸水紙吸去葉盤上的接種液,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。接種7d后,計(jì)算各處理的病情指數(shù)。利用DPS軟件中的系統(tǒng)聚類,采用卡方距離法計(jì)算各處理間的聚類距離,用離差平方和法進(jìn)行聚類分析[6]。

    相關(guān)計(jì)算方法及標(biāo)準(zhǔn)劃分為:(1)發(fā)病率(%)=(發(fā)病葉盤數(shù)/總?cè)~盤數(shù))×100。(2)參考劉旭等[2]的研究劃分病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),并稍加改動(dòng):0級(jí),無病斑;1級(jí),病斑面積占葉盤面積5%以下;3級(jí),病斑面積占葉盤面積5%~20%;5級(jí),病斑面積占葉盤面積20%~50%;7級(jí),病斑面積占葉盤面積50%以上。病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病葉盤數(shù)×相對(duì)級(jí)值)/(調(diào)查總?cè)~盤數(shù)×7)×100。(3)抗性類型:高抗(HR),病情指數(shù)為0~5.0;抗病(R),病情指數(shù)為5.0~25.O;感病(S),病情指數(shù)為25.0~50.0;高感(HS),病情指數(shù)為50.0~100.0。

    1.4葡萄霜霉病菌基因組的提取

    取1.5mL離心管,加入適量的95%乙醇,用尖頭鑷子夾取新鮮的葡萄霜霉病菌孢子囊梗及孢子囊于乙醇中,4000r/min離心10min,去上清液,收集霜霉病菌。參考穆春華等[7]的方法提取葡萄霜霉病菌的基因組DNA。

    1.5葡萄霜霉病菌rDNA-ITS序列的擴(kuò)增與分析

    以葡萄霜霉病菌基因組DNA為模板,用引物ITS1F:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4R:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'擴(kuò)增rDNA-ITS序列。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸2min20s,35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10min。切膠回收目的片段,送測序公司測序。

    通過DNAMAN軟件和Clustalx1.83軟件對(duì)rDNA-ITS序列進(jìn)行比對(duì),利用MEGA5.0分析軟件中的Neighbor-Joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。endprint

    2結(jié)果與分析

    2.1不同葡萄霜霉病菌株的致病力

    通過葉盤接種法將13個(gè)不同葡萄霜霉病菌株分別接種在6個(gè)鑒別寄主葡萄上,對(duì)菌株的致病性進(jìn)行測定。接種7d后,發(fā)病嚴(yán)重的可在葉盤接種處出現(xiàn)較大病斑,并有大量白色霉層產(chǎn)生(圖1A);發(fā)病輕者沒有病斑或僅可見褐色侵染點(diǎn),極少或不產(chǎn)生白色霉?fàn)钗铮▓D1B)。從表2可以看出,供試13個(gè)葡萄霜霉病菌株均有致病性。但是,當(dāng)13個(gè)菌株同時(shí)接種抗病性較強(qiáng)的夏黑品種時(shí),從病情嚴(yán)重度來看,接種JYrf和BZdd的病指僅為0.48,而接種JYsg.DZln、DZhw和DZSdyj的病指卻都達(dá)到50.00以上;從抗性反應(yīng)來看,出現(xiàn)了高感、感病、抗病和高抗4個(gè)類型。接種高抗病品種摩爾多瓦也表現(xiàn)出了相似的發(fā)病特點(diǎn)。同時(shí),當(dāng)寄主為感病性較強(qiáng)的貴妃玫瑰和紅提品種時(shí),病指范圍分別為28.57~79.05和27.62~77.62,病指差均在50左右。由此可以得出,山東葡萄霜霉病菌株間存在著明顯的致病力分化。

    對(duì)供試菌株的致病力進(jìn)行聚類分析,可以看出(圖2),13個(gè)菌株大致可聚為3組,第1組是致病力較強(qiáng)的菌株,為DZhw、DZln、JYsg和DZS-dyj,占30.8%;第Ⅱ組是致病力中等的菌株,為JNzg、XTyjz、MYxz、DZSdt、PYwt和QDnlk,占46.2%;第Ⅲ組是致病力較弱的菌株,為JYrf、BZdd和DYmt,占23.1%。因此,將13個(gè)菌株可劃分為強(qiáng)、中、弱3種致病類型,其中,中等致病型菌株為優(yōu)勢菌株。

    從圖2還可以看出,JYrf的致病力最弱,而同樣是采自濟(jì)陽縣的JYsg致病力最強(qiáng),所以,地域來源很近的菌株可以表現(xiàn)為不同的致病型;同時(shí)地域來源較遠(yuǎn)的菌株JNzg、MYxz和QDnlk又可以聚在一起,均為中等致病型。因此,山東葡萄霜霉病菌致病力差異與菌株的地域來源無明顯相關(guān)。

    2.2供試葡萄霜霉病菌株的親緣關(guān)系

    對(duì)13個(gè)葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果顯示,所有菌株與登錄號(hào)為DQ665668.1的葡萄霜霉病菌高度同源,同源性均為99%。因此,這13個(gè)霜霉菌株與已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的親緣關(guān)系很近,屬于同一個(gè)種。進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn),13個(gè)菌株間的同源性可高達(dá)99.94%,其中,JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的同源性為100%,DZln和QDnlk有4個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生變異,其他菌株有1~3個(gè)堿基變異位點(diǎn)。由此可以得出,采自山東地區(qū)的13個(gè)葡萄霜霉病菌株之間的親緣關(guān)系很近,但rDNA-ITS序列間仍然存在一定差異。

    根據(jù)以上序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,從樹形結(jié)構(gòu)可以看出(圖3),JYrf、DZSdyj、DYmt、PYwt、MYxz和DZhw與已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的親緣關(guān)系最近,聚在同一分支內(nèi),同源性為99.98%。同為來自青島地區(qū)的DZSdyj、DZSdt和QDnlk菌株分散地聚在了不同的分支中。由此可以得出,葡萄霜霉病菌株間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與菌株的地域來源無相關(guān)性。

    2.3葡萄霜霉病菌株致病力差異與rDNA-ITS序列多態(tài)性的關(guān)系

    為了明確葡萄霜霉病菌株間致病力的差異是否與rDNA-ITS序列的差異有關(guān),對(duì)致病力(圖2)及系統(tǒng)發(fā)育(圖3)進(jìn)行了綜合分析,可以得出,在強(qiáng)致病力菌株中,DZhw和DZSdyj的同源性為100%,與JYsg的遺傳距離較遠(yuǎn),rDNA-ITS序列差異較大;在弱致病力菌株中,JYrf和DYmt的同源性為100%,而BZdd則聚在了其他進(jìn)化分支內(nèi)。即使JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的rDNA-ITS序列完全一致,致病力也表現(xiàn)出了強(qiáng)、中、弱的差異。因此,葡萄霜霉病菌株間的致病力差異與rDNA-ITS序列的多態(tài)性無相關(guān)性。

    3結(jié)論與討論

    致病性測定是真菌研究中的重要環(huán)節(jié),可為真菌的遺傳多樣性、致病相關(guān)基因、致病機(jī)制等研究提供依據(jù),因此,病原菌的接種技術(shù)是這些研究的關(guān)鍵所在。本研究發(fā)現(xiàn),孢子囊在22℃下1h即可萌發(fā),24h萌發(fā)率約為50%。有研究報(bào)道[8.9],葡萄葉片氣孔對(duì)游動(dòng)孢子具有向性引力,游動(dòng)孢子釋放后會(huì)向氣孔游動(dòng),約半小時(shí)后停止游動(dòng)形成休止孢,長出芽管從氣孔侵入。因此,我們選擇剛收集到的新鮮孢子囊用于接種,以利于游動(dòng)孢子在釋放后迅速游動(dòng)到氣孔附近進(jìn)行侵染,保證侵染活性及測定結(jié)果可靠性。在前期試驗(yàn)中對(duì)孢子囊的接種濃度也進(jìn)行了摸索,發(fā)現(xiàn)濃度低時(shí)侵染率較低,而高濃度更利于發(fā)病,最終選用1×105個(gè)孢子囊/mL作為病菌的接種濃度,這也與Polesani等[10]、Díez-navajas等[11]和Liu等[12]在研究中所使用的孢子囊量相近,可以實(shí)現(xiàn)較好的發(fā)病效果。

    葡萄品種的抗病性不隨霜霉病菌菌源的改變而改變[13],因此我們?cè)谇捌谑覂?nèi)、田間接種試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,挑選出6個(gè)不同抗病性且在山東地區(qū)較為普遍種植的葡萄品種作為鑒別寄主。本研究結(jié)果表明,13個(gè)葡萄霜霉病菌株均具有致病性,并且存在明顯的致病力分化,由此推測,有不同生理小種的存在,這Boubals[3]的研究發(fā)現(xiàn)相一致。此外,李華[14]的研究結(jié)果也表明,不同霜霉病菌株接種不同抗性葡萄品種,菌株間表現(xiàn)出了致病力差異,但不存在寄主-病原間的特異性互作,由此提出了葡萄與葡萄霜霉菌之間的水平系統(tǒng)學(xué)說,同時(shí),他還認(rèn)為,葡萄霜霉病菌的致病力差異首先表現(xiàn)在其孢子囊大小和其中所含細(xì)胞核數(shù)量的差異,換言之,就是霜霉菌的異核現(xiàn)象引起了致病力的不同[15]。研究中我們還發(fā)現(xiàn),有些菌株在接種抗病性較強(qiáng)的摩爾多瓦和夏黑時(shí),葉盤上特別是接種點(diǎn)處會(huì)出現(xiàn)褐色點(diǎn)狀侵染斑(圖1B),鏡檢發(fā)現(xiàn)這些變色組織主要集中在氣孔周圍,此前有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為抗病葡萄葉片在受到霜霉菌侵入時(shí)會(huì)在氣孔周圍形成胼胝質(zhì)沉積物[16],這一物質(zhì)會(huì)穿透寄主細(xì)胞形成一道屏障從而阻止侵染菌絲進(jìn)一步展[9],同時(shí)還會(huì)阻斷吸器與寄主細(xì)胞之間的物質(zhì)交換[17],所以這些侵染斑可能是因胼胝質(zhì)的阻礙使得生長受到局限的霜霉菌引起的癥狀。但相對(duì)于出現(xiàn)以上侵染表型的菌株,JYsg、QDnlk和MYxz仍然可以在摩爾多瓦葉盤上長出較多霉層,因此該病菌的致病機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

    目前,rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌的分類鑒定、種間親緣關(guān)系研究、植物病原真菌檢測等方面已得到廣泛應(yīng)用。為了弄清這13個(gè)葡萄霜霉病菌株的親緣關(guān)系,我們對(duì)它們的rDNA-ITS序列進(jìn)行了Blast分析,結(jié)果表明這13個(gè)菌株與GenBank中的DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源,同源性均為99%,而且菌株間的同源性可高達(dá)99.94%,差異菌株只發(fā)生了個(gè)別堿基位點(diǎn)的變異。這與賈姝等[4]的研究結(jié)果相一致,他們?cè)谶|寧地區(qū)采集了21個(gè)葡萄霜霉病菌株,這些菌株也都與DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源,并且菌株間的遺傳距離很近。這些都說明,rDNA-ITS序列在葡萄霜霉病菌的種內(nèi)是非常保守的,這將為該病菌的遺傳進(jìn)化研究提供參考。endprint

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