產(chǎn)纖維素酶菌株B.subtilis SD-76產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

趙春雷，王金浩，王應(yīng)中，陳 丹，李 悅，排玲玲，金鐵鈴，胡永金*(.云南創(chuàng)新生物產(chǎn)業(yè)孵化器管理有限公司，云南昆明6507;.云南萬(wàn)芳生物技術(shù)有限公司，云南昆明6507;.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明6500)

纖維素是高等植物細(xì)胞壁的主要成分，是生物圈中最廉價(jià)、最大量永不枯竭的可再生性碳源資源。地球上植物體每年通過(guò)光合作用生成數(shù)千億噸有機(jī)資源，其中三分之一以上為纖維素資源。但這些儲(chǔ)存的能量和碳，植物體自身并不重復(fù)利用，絕大部分纖維素資源如枯枝落葉等只能廢棄到環(huán)境中，造成了資源的巨大浪費(fèi)和環(huán)境的污染。有效地轉(zhuǎn)化、開發(fā)和利用這一豐富天然資源，對(duì)于解決工農(nóng)業(yè)原料來(lái)源、能源危機(jī)、環(huán)境污染等具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［1－4］。

目前，生物降解是纖維素降解方面研究最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法。但在生物降解應(yīng)用過(guò)程中，除選育高產(chǎn)優(yōu)良纖維素酶(CMCase)菌株外，產(chǎn)酶發(fā)酵條件同樣非常重要。即使同一菌種，若培養(yǎng)基類型、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及發(fā)酵條件不同，菌種產(chǎn)酶的能力也存在較大差異。對(duì)于不同菌種，則產(chǎn)酶差異更大。因此，筆者以大圍山原始森林土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶活力高的菌株B.subtilis SD-76為出發(fā)菌，探討培養(yǎng)基起始pH、碳源、氮源和發(fā)酵溫度對(duì)高產(chǎn)纖維素酶菌株B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響，并通過(guò)正交分析確定產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件，以期為提高B.subtilis SD-76產(chǎn)纖維素活力和該菌株的工業(yè)產(chǎn)酶生產(chǎn)提供一定的參數(shù)和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 菌種:B.subtilis SD-76，分離自云南大圍山原始森林土壤。

產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉10 g，硫酸銨4 g，磷酸二氫鉀2 g，七水合硫酸鎂0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，加水至1 000 ml。121℃，滅菌30 min后冷卻備用。

其他原料:碳源:麩皮，玉米芯，羧甲基纖維素(CMC)，玉米秸稈，稻草粉，豆渣。麩皮、玉米芯、玉米秸稈用小型粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)20目篩后備用。氮源:2.0 g/L牛肉膏，2.0 g/L 蛋白胨，4.0 g/L 酵母粉，1.5 g/L 硫酸銨，2.5 g/L 硝酸鈉，1.5 g/L 氯化銨。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初始pH對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響。用磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液將培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)制成2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8，接種后于 30 ℃恒溫培養(yǎng) 72 h，測(cè)定其酶活力。每組3個(gè)平行。

1.2.2 溫度對(duì) B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響。將接種B.subtilisSD－76后的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于24、26、28、30、32、34和36℃，恒溫培養(yǎng)72 h后，測(cè)定其酶活力。每組3個(gè)平行。

1.2.3 碳源對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響。分別以麩皮、玉米芯、CMC、玉米秸稈、稻草粉、豆渣作為唯一碳源，培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌，接種后于30℃恒溫培養(yǎng)72 h，測(cè)定其酶活力。每組3個(gè)平行。

1.2.4 氮源對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響。分別將牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨溶解于10 ml水中，分別加入裝有10 g稻草粉的250 ml三角瓶中，攪拌均勻，121℃滅菌接種后于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，測(cè)定其酶活力。每組3個(gè)平行。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素發(fā)酵產(chǎn)酶的基礎(chǔ)上，以初始pH、發(fā)酵溫度、稻草粉濃度、硫酸銨濃度4個(gè)因素作為影響菌株B.subtilis SD-76發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的主要因子。設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平L9(34)

1.2.6 纖維素酶活性測(cè)定。CMCase酶活的測(cè)定參照文獻(xiàn)［5］。

1.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響 由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在2.8～6.8時(shí)，隨著pH的升高，菌株B.subtilis SD-76產(chǎn)纖維素酶呈上升趨勢(shì)，當(dāng)初始pH 6.8時(shí)纖維素酶活力達(dá)到最大值392.83 U。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH大于6.8后，隨著pH的增加菌株B.subtilis SD-76產(chǎn)纖維素酶呈下降趨勢(shì)。因此選擇起始pH 6.8。

圖1 初始pH對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響

2.2 溫度對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響 由圖2可知，當(dāng)溫度在20～30℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度增加，菌株B.subtilis SD-76產(chǎn)纖維素酶呈上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)纖維素酶活力最高，可達(dá)395.47 U。而纖維素酶活力達(dá)到最高值后，隨發(fā)酵溫度繼續(xù)升高則產(chǎn)酶下降。可見發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶效果有明顯影響，因此發(fā)酵溫度選擇30℃。

圖2 溫度對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響

2.3 碳源對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，所選的幾種碳源都能使B.subtilis SD-76產(chǎn)酶，但不同的碳源，產(chǎn)酶量不同。產(chǎn)酶量最高的是稻草粉，其次為玉米芯、豆渣、CMC和玉米秸稈，最低的是麩皮。

圖3 碳源對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響

2.4 氮源對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響 由圖4可知，所選用的幾種氮源都能使B.subtilis SD-76產(chǎn)酶，但不同的氮源，產(chǎn)酶量不同。其中硫酸銨為氮源能夠有效提高產(chǎn)纖維素酶的能力，因此選擇硫酸銨作為氮源。

圖4 氮源對(duì)B.subtilis SD-76產(chǎn)酶的影響

2.5 菌株B.subtilis SD-76的最佳產(chǎn)酶條件 對(duì)正交試驗(yàn)各搖瓶編號(hào)的提取酶液，測(cè)定CMCase活性。結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，以CMCase活力為衡量指標(biāo)時(shí)，初始pH、發(fā)酵溫度、稻草粉濃度、硫酸銨濃度4個(gè)因素對(duì)酶活力大小影響次序?yàn)锳、B、C、D，即影響 B.subtilis SD-76產(chǎn)酶最大的是培養(yǎng)基初始pH，其次為發(fā)酵溫度、硫酸銨濃度和稻草粉濃度。B.subtilis SD-76產(chǎn)纖維素酶的最佳條件為A3B3C2D3，即發(fā)酵最佳條件為pH 6.8，溫度32℃，稻草粉濃度3.0 g/L，硫酸銨濃度為3.5 g/L，該菌株的酶活達(dá)到462.34 U。

3 結(jié)論

(1)適合該菌株B.subtilis SD-76液體搖瓶發(fā)酵的碳源為稻草粉;氮源為硫酸銨;培養(yǎng)基初始pH為6.8;發(fā)酵溫度為30℃。在最適pH和最適溫度下培養(yǎng)，該菌株的纖維素酶活力分別達(dá)到392.83和395.47 U。

(2)菌株B.subtilis SD-76的最佳產(chǎn)酶條件為:培養(yǎng)基初始pH為6.8;發(fā)酵溫度為32℃;稻草粉濃度為3.0 g/L;硫酸銨濃度為3.5 g/L。在最佳條件下培養(yǎng)，該菌株的酶活達(dá)到462.34 U。

［1］陳洪章，李佐虎.纖維素原料微生物與生物量全利用［J］.化工科技市場(chǎng)，2001(5):17－20.

［2］DUNLAP C E，CHIANG L C.Cellulose degradation-a common Link［M］//SHULER M L.Utilization and recycle of agriculture wastes and residues.Boca Raton，F(xiàn)lorida:CRC Press Inc，1980.

［3］薛橋麗，王煒，胡永金，等.堆肥中高溫纖維素酶菌株的篩選及其酶性質(zhì)研究［J］.中國(guó)釀造，2012，31(1):30 －33.

［4］陳洪章.纖維素生物技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［5］ACEBAL C，CASTILLON M P，ESTRADA P，et al.Enhanced cellulase production from Trichodermo reesei QM9414 on physically treated wheat straw［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1986，24:218 －223.