合成Hg-DADPA柱分離含硒或硫化合物的研究

韓維娜，張 震，師 帥，柴 奇，劉學(xué)娜*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150081;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)，黑龍江大慶163319)

研究植物及微生物體內(nèi)生物大分子的結(jié)構(gòu)修飾，對單一成分的純化是一個重要且繁瑣的過程［1－5］。到目前為止，在組成總核糖核酸(tRNA)中共存在107種不同結(jié)構(gòu)修飾的核苷。越來越多的化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對硫或硒修飾的tRNA及其功能感興趣［6］，已發(fā)現(xiàn)近23種不同的硫和硒核苷修飾的tRNA［7］。到目前為止，研究微生物體 DNA與RNA的硒和硫結(jié)構(gòu)修飾大多使用同位素示蹤法，雖然靈敏度高，但是其放射性限制其在一般實驗室的應(yīng)用。因此，合成新的分離材料一直是一個熱點。已有報道表明，用交聯(lián)葡萄糖凝膠色譜從消化過的核苷酸混合物中選擇性地分離出4－和2－硫代尿嘧啶核苷［8］。但是，目前還沒有連接到對氯汞苯甲酸的報道。硫與硒在元素周期表中屬于同一主族，因此其化學(xué)性質(zhì)相似。如果某些載體能與硫結(jié)合，那么就能將含硒化合物分離。根據(jù)這個原則，筆者合成了一種新的汞柱，設(shè)計路線見圖1。

合成的Hg-DADPA色譜純化化合物是一個可逆過程。通過不同濃度的HCl洗脫，將不同位置硫或硒修飾的核苷酸選擇性地分離。該研究方法簡單，成本低，不破壞化合物的穩(wěn)定性。Hg-DADPA色譜的高選擇性和高回收率可推廣至天然產(chǎn)物中含硫、含硒化合物及未知化合物的富集和分離，為下一步鑒定提供樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 HR-MASS質(zhì)譜儀(美國Waters公司);ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)。碳酸氫鈉(NaHCO3)pH 8.8，偶聯(lián)緩沖液(0.1 mol/L MES，濃度 0.9%NaCl，pH 4.7)，DADPA 瓊脂糖購買于 Thermo公司;對氯汞苯甲酸、1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基碳二亞胺(EDC)和UTP購于Sigma公司;2－硫代尿嘧啶(2-SU)、2－硒代尿嘧啶(2-SeU)和4－硒代尿嘧啶核苷(4-SeUTP)由實驗室提供。Baseline-ZEROTMDNase，RNase A，RiboShredderTMRNase Blend購買于Epicentre公司。

LB的組成:分別稱取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉，加1 L雙蒸水，定容，加熱攪拌至溶解，滅菌后，在室溫下放置，備用。

圖1 設(shè)計路線

1.2 Hg-DADPA色譜的合成 取3 ml二氨基二異丙基瓊脂糖 DADPA(16 ～20 μmol氨基/ml樹脂)，加入到0.5 cm ×8 cm柱中(最后柱床高度1 cm)，自由滴下，使存儲的緩沖液耗盡后，分3次加入偶合緩沖液(0.1 mol/L MES，濃度0.9%NaCl，pH 4.7)，每次 3 ml，沖洗干凈。在整個過程中，不要使樹脂床干燥;平衡樹脂，最后添加偶合緩沖液9 ml，轉(zhuǎn)移DADPA瓊脂糖至25 ml容量瓶中。取0.306 mmol對氯汞苯甲酸，溶解到6 ml二甲基甲酰胺中，混合幾分鐘，溶解后轉(zhuǎn)移到 25 ml容量瓶中。另取0.774 mmol的 EDC 0.3 ml，溶解到偶合緩沖液中，然后加入裝有樹脂的圓底燒瓶中，在室溫下攪拌，經(jīng)過18 h反應(yīng)，樹脂轉(zhuǎn)移到層析柱中，并且添加洗滌緩沖液(0.1 mol/L NaHCO3(pH=8.8))，洗滌至澄清，放至 4℃保存，備用。

1.3 Hg-DADPA色譜分離混合物 混合4-UTP、UTP、2-SU和2-SeU，使用Hg－DADPA色譜柱分離。步驟如下:使用移液器分別取2 μl的 10 mmol/L UTP(A)、2-SU(B)、2-SeU(C)和4-SeUTP(D)，混合，然后加入1.8 ml雙蒸水作為樣品。使用Hg-DADPA色譜分離樣品，洗脫劑分別是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脫的餾分都要通過紫外全波長掃描檢測，合并相同樣品。其中，在13管、14管之間加雙蒸水10 ml，洗脫殘存的碳酸氫鈉。

A=ECL計算樣品回收率(n=3)

1.4 從大腸桿菌菌株K12(MG1665)提取tRNA 添加少量的大腸桿菌于LB中，4℃過夜，離心(6 000 r/min)8 min，棄上清液;留下約250 μl液體;加入含1 ml蛋白酶K組織和300 ml細(xì)胞裂解液，渦旋振蕩5 min，65℃孵育120 min，再將樣品置于冰上15 min，添加含175 ml的MPC蛋白沉淀試劑300 ml溶解樣品，渦旋振蕩1 min，4℃，離心(13 000 r/min)30 min;加入500 ml異丙醇，回收上清液;顛倒離心管30～40次，4℃離心20 min，小心倒出異丙醇;用濃度70%乙醇漂洗2次，不要接觸沉淀;離心，用移液管取出所有殘留的乙醇，得到總DNA和總RNA;加入6 ml不含RNA酶的游離水后，再加入 Baseline-ZEROTMDNase 200 μl(10 ×緩沖液，0.69 ml)，37℃過夜;加入0.77 ml 3 mol/L NaCl，然后加入8 ml異丙醇，顛倒離心管30～40次;4℃，離心(3 000 r/min)30 min，得到tRNA。重復(fù)1次。

1.5 tRNA的消化和含硫核苷酸化合物的富集 將tRNA重新溶于3 ml雙蒸水中，加入0.5 ml 5 μg/μl的 RNA 酶 A，混勻，并在37℃過夜孵育。然后，經(jīng)Hg-DADPA色譜柱分離含硫或硒的核苷酸，洗脫劑分別是 0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中 0.6 ml/管，每份洗脫的餾分都要通過紫外全波長掃描檢測，合并相同樣品。

1.6 含硫核苷酸化合物的鑒定 水解tRNA后，經(jīng)過Hg-DADPA色譜富集含硫、含硒核苷酸化合物，得到樣品A和B，將樣品經(jīng)HPLC分析。HPLC條件如下:PRP-1反相柱，流速1 ml/min，柱溫25℃，流動相A為10 mmol/L TEAAc(pH 7.1)，流動相 B為含濃度60%CH3CN的10 mmol/L TEAAc(pH 7.1)。梯度洗脫，0～15 min 100%B，16～20 min 100%A到30%B，檢測波長260、326 nm。對HPLC的每個組分進(jìn)行ESI(-)-MS和HR-MS鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成DADPA-Hg柱對混合物的分離和回收率測定 混合的UTP(A)、2-SU(B)、2-SeU(C)和4-SeUTP(D)有不同的最大紫外吸收峰，分別為260、300、307、365 nm。柱層析洗脫次序見圖2。重復(fù)3次，使用計算公式:A=ECL，計算樣品回收率，式中A代表吸光度;E代表吸光系數(shù);C代表濃度;L代表比色皿厚度。UTP、2-SU、2-SeU、4-SeUTP的回收率分別約73%、87%、90%、85%(n=3)。Hg-DADPA色譜柱能夠高效地通過不同濃度的HCl洗脫劑分離不同含硫或硒的化合物，且可重復(fù)使用。

2.2 樣品穩(wěn)定性 由表1可知，室溫放置4 d后，2－硒代尿嘧啶核苷比4－硒代尿嘧啶核苷穩(wěn)定，在酸性條件下4－硒代尿嘧啶核苷幾乎100%降解;硒取代的化合物在中性和堿性條件下比酸性條件下要穩(wěn)定，其中在中性條件下化合物幾乎沒有發(fā)生降解，pH越低，化合物的穩(wěn)定性越差。2－硒代胸腺嘧啶核苷和4－硒代胸腺嘧啶核苷具有同樣的試驗結(jié)果，即2位比4位穩(wěn)定，在酸性條件下化合物具有不穩(wěn)定性。

2.3 未消化前提取大腸桿菌得到tRNA的總量和純度 從1 L大腸桿菌中提取得到9 ml的RNA，取2 μl稀釋到800 μl水中，得到紫外圖譜，計算A260/A280=1.96，表明RNA純度達(dá)到90%以上。

2.4 tRNA的消化和含硫、含硒核苷酸化合物的富集 0.1 mol/L鹽酸洗脫液在326 nm處有吸收(11～13管，樣品A)，0.5 mol/L鹽酸洗脫液在326和260 nm處均有吸收(樣品B)，通過紫外檢測，大致能夠判斷水解程度，A260/A326為4～10(樣品B)，判斷RNA沒有徹底水解，每個修飾上面大概平均連接有4～6個未被修飾的堿基。由圖3可知，所有餾分均顯示在256 nm處有吸收。這可能由于是核苷酸降解后產(chǎn)生不完全水解。然而，11～13管均在326 nm處有強(qiáng)吸收，故此合并作為樣品A，將進(jìn)一步分析326 nm峰的組成。

表1 UTP、2-SU、2-SeU和4 SeUTP在不同溶劑、不同時間下的穩(wěn)定性

圖2 Hg-DADPA柱對硫硒修飾不同位置化合物的分離

圖3 tRNA消化后，富集含硫及含硒核苷酸化合物

圖4 加入不同濃度B2A6和不同pH樣品A反應(yīng)的紫外圖譜

2.5 樣品A的鑒定與分離

2.5.1 樣品A的鑒定。首先，以B2H6為還原劑，加入后發(fā)現(xiàn)沒有造成任何紫外吸收峰的改變(圖4)。但是，樣品A對pH敏感，尤其是在堿性條件下。樣品吸收峰在酸性條件下轉(zhuǎn)變非常緩慢，而在堿性條件下pH改變吸收峰也迅速發(fā)生改變。根據(jù)吸收峰的數(shù)值，這些變化可能是硫取代的核苷(硫尿嘧啶核苷)造成的。因此，據(jù)預(yù)測，樣品A主要是寡核苷酸，且含有硫尿嘧啶的結(jié)構(gòu)。

2.5.2 樣品A的分離。樣品A經(jīng)過高效液相分析，收集到6個不同的組分，前5個無色，第6個黃色(圖5)。

2.5.3 化合物鑒定。對HPLC的每個組分進(jìn)行ESI(－)-MS and HR-MS鑒定。通過ESI(－)-MS(圖6)，分析所有的組分。684 m/z(M+－1)存在于后3個組分中，而668 m/z(M+－1)在6個組分中都存在，742 m/z(M+－1)存在于后3個組分中。水解RNA的酶核糖核酸酶A(RNA酶A)是一個內(nèi)源性的殘留3'端嘧啶，最終形成3'－嘧啶－3'－磷酸寡居核苷酸，因此根據(jù)紫外吸收峰和HR-MS，這2個峰分別對應(yīng)到鳥嘌呤－2－硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤－3－硫代尿嘧啶核苷酸和鳥嘌呤－5－甲酰－2－尿嘧啶核苷酸(表2、圖7)。

表2 大腸桿菌的tRNA消化后的核苷酸通過HR-MS的修飾和鑒定

3 討論

使用二氨基二異丙基瓊脂糖(DADPA)與對氯汞苯甲酸進(jìn)行反應(yīng)，得到Hg-DADPA色譜。用不同濃度的鹽酸洗脫不同位置取代的硫或硒修飾化合物。這個反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)。當(dāng)增加HCl用量時，被Hg-DADPA色譜反應(yīng)結(jié)合的產(chǎn)物會被游離出來，從而被洗脫，而當(dāng)更換成其他酸時，不能達(dá)到洗脫和分離。Hg-DADPA色譜對酸是穩(wěn)定的，因此Hg-DADPA色譜的再生可以使用0.5 mol/L HCl洗脫除雜，從而活化。Hg-DADPA還具有一些優(yōu)點，如可重用性和高可靠性、高回收率。試驗結(jié)果顯示，最低的回收率達(dá)80%以上。該研究材料將幫助含硫和含硒修飾的內(nèi)源性大分子的富集，從而有助于進(jìn)一步確定生物大分子的修飾位置。

圖5 HPLC分析和分離樣品A

圖6 大腸桿菌的tRNA消化后的核苷酸HR-MS

圖7 化合物結(jié)構(gòu)

使用合成的汞柱對來自大腸桿菌K12的tRNA中的含硫、含硒化合物分離，通過HR-MS鑒定得到鳥嘌呤－2－硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤－3－硫代尿嘧啶核苷酸和鳥嘌呤－5－甲酰－2－尿嘧啶核苷酸3個化合物。消化時使用RNA酶A，存在如下原因:核糖核酸酶A是一個內(nèi)源性的核糖核酸酶，將最終水解得到3'－嘧啶－3'－磷酸根［9－10］。分離、富集后在326 nm處的吸收峰是類似合成的4－硫尿嘧啶核苷酸(峰值在330 nm處)。根據(jù)這一特點，進(jìn)一步通過ESI-MS和HR-MS確定大腸桿菌核苷酸的RNA的G-4-硫代尿嘧啶核苷酸、A-3-硫代尿嘧啶核苷酸及G-5-甲酰-4-硫代尿嘧啶核苷酸。然而，沒有發(fā)現(xiàn)硒修飾核苷酸?？赡艿脑蚴且阎淖匀话l(fā)生的硫和硒核苷在所有類型的RNA修飾中非常低，因此下一步將擴(kuò)大培養(yǎng)。

總之，已合成新的Hg-DADPA色譜，可用于分離硫和硒修飾的RNA。這是一個經(jīng)濟(jì)和安全的純化方法，具有重復(fù)性和選擇性。2005年，上海交通大學(xué)的科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)一種新的DNA修飾，即DNA修飾中含有硫。這在核酸的研究上屬于里程碑的科學(xué)文件［11－12］。這表明含有硒的DNA或RNA的修飾也可能存在于其他生物體中，或存在于更特殊的自然條件下生存的生物(如隕石坑的植物和微生物)。合成汞柱將有助于富集含硫含硒DNA或RNA修飾，使得檢測簡化，同時避免同位素對人體的傷害。今后，將使用這種新合成的Hg-DADPA色譜從天然植物中富集硫和硒衍生物。

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