擬南芥 CDR6基因過表達(dá)載體構(gòu)建及過量表達(dá)植株篩選鑒定

董萬春，樊婷婷，陽立波，江海坤，張其安，方 凌，倪嬌嬌，管靈霞，曹樹青

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009;2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，安徽合肥230009)

擬南芥CDR6基因cDNA全長1 120 bp，編碼一種含有NC結(jié)構(gòu)域的功能未知蛋白［1－3］，目前對其生物學(xué)功能研究尚未見報道。筆者通過功能缺失型突變體篩選，獲得cdr6－1突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體種子具有耐鉛的特性，后來經(jīng)過PCR克隆出CDR6基因。為進一步研究該基因的功能，筆者構(gòu)建了35S┊CDR6過量表達(dá)載體，然后利用基因工程技術(shù)通過轉(zhuǎn)基因、篩選、鑒定，獲得了過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，為進一步揭示擬南芥對重金屬耐受的分子機理［4－5］奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。哥倫比亞野生型擬南芥WT，購于美國擬南芥種質(zhì)資源中心，由合肥工業(yè)大學(xué)生物與與食品工程學(xué)院分子生物學(xué)實驗室自行繁衍保存。

1.1.2 主要試劑。EazyTaq DNA Polymerase(TransGen)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa);TIANGel MiDi Purification Kit、T4DNA 連接酶、TIANprep MiniPlasmid kit、TIANquick MiDi Purification Kit(TIANGEN 公司);XhoI和HindIII限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。

1.1.3 宿主菌和載體。平末端載體感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、農(nóng)桿菌GV3101、pXB094載體(改造后帶有35S強啟動子和NOS轉(zhuǎn)錄終止子)。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥平板培養(yǎng)。用25%次氯酸鈉浸洗種子2 min，再用無菌水洗滌4～5次，將種子轉(zhuǎn)移到濾紙上晾干后，播于1/2MS固體培養(yǎng)基中，置于4℃冰箱春化3 d后置于培養(yǎng)室［培養(yǎng)條件為溫度23℃、光照強度100 μmol/(m2· s)、光照時間18 h/d］培養(yǎng)14 d。

1.2.2 擬南芥植株總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將研缽洗凈，于干燥箱中高溫殺菌3 h，然后冷卻至室溫。取約100 mg擬南芥材料置于研缽中，加入液氮將植株磨碎后，加入1 ml Trizol裂解液，繼續(xù)研磨至材料融化，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管;然后向其中加入200 μl氯仿(預(yù)冷)，強烈振蕩15 s，室溫靜置5 min，然后于4℃、12 000 r/min離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，向其中加入500 μl異丙醇(預(yù)冷)，顛倒混勻，室溫靜置10 min，然后于 4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入1 ml 75%乙醇(750 μl無水乙醇+250 μl DEPC處理水)，溫和顛倒離心管，然后于4℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫晾曬5～10 min，讓乙醇揮發(fā)完全，最后向離心管中加入30～50 μl DEPC處理水溶解RNA(可于58℃水浴10 min);檢測其濃度及含量。為防止降解，立即將RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。

1.2.3 CDR6基因擴增。用Oligo7.0軟件設(shè)計引物:正向引物FP1:NNNCTCGAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA;反向引物RP1:NNNAAGCTTACTCGTGCTTGGTAAAGCTATG。鑒定陽性植株所用PCR擴增引物為:正向引物FP2:NNNCTC-GAGATGGGTCTTCTCTCCAACAGA;反向引物RP2:GAACTTCAGGGTCAGCTTGC。以cDNA為模板進行PCR擴增。

1.2.4 酶切、連接、轉(zhuǎn)化和測序。用限制性內(nèi)切酶XhoI和HindIII同時酶切CDR6基因片段與載體pXB094，并回收純化。用T4連接酶連接酶切片段，并將其轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)，用含有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并進行菌落PCR驗證，將驗證正確的克隆接種于含壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒并電泳檢測，送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.5 浸花法侵染擬南芥植株。將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌，挑取單菌落進行菌落PCR驗證。將驗證無誤的陽性克隆接種于含壯觀霉素和慶大霉素的LB培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD600為1.2左右;將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清;用滲透緩沖液(1/2 MS培養(yǎng)基+5%蔗糖)重懸至OD600=0.8～1.0，加入終濃度為0.03%Silwet－L77，混勻;事先將待侵染植株的果莢去除，用滲透緩沖液侵染花序10～15 s，侵染完成后，將植株用保鮮膜包裹好，放入紙箱避光培養(yǎng)24 h后取下保鮮膜，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDR6基因的克隆 以cDNA為模板擴增CDR6基因，將PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖1a。CDR6基因CDS序列長780 bp，條帶大小與目的片段大小一致，說明成功克隆出CDR6基因。另外對pXB094質(zhì)粒進行電泳檢測，結(jié)果見圖1b。

2.2 CDR6基因過量表達(dá)載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶XhoI和HindIII同時對基因CDR6和pXB094載體進行雙酶切，切膠回收后，電泳檢測結(jié)果見圖2。用含壯觀霉素的LB平板篩選陽性單克隆，菌落PCR驗證，電泳檢測結(jié)果見圖3，擴增出的條帶大小正確。對測序結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)序列100%比對，說明CDR6過表達(dá)載體構(gòu)建完成。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選 植株侵染后，收取T0代種子。用含有卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選種子，篩選結(jié)果見圖4，箭頭所指幼苗很綠可以存活的為陽性株，將其移栽至土壤中進行培養(yǎng)，待幼苗長大后，提取野生型和轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，并以此為模板進行PCR鑒定。所用引物擴增出的PCR產(chǎn)物總長度為1 000 bp左右，對照植株無條帶，陽性植株有條帶(圖5中1～8號株系)，說明鑒定出的轉(zhuǎn)基因植株為陽性植株。

3 結(jié)論與討論

重金屬造成的土壤和水源污染已對全球的食品安全、人類身體健康、生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前已克隆出一些植物抗重金屬基因并對其抗逆機理進行了深入研究，這種將外源抗逆基因?qū)胫参锘蚪M的基因工程技術(shù)，在提高植物抗逆性、改良植物遺傳性狀及改善土壤重金屬污染問題等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［7－9］。前期研究結(jié)果顯示，功能缺失型突變體cdr6-1在鉛脅迫下與WT相比表現(xiàn)出更為耐受的特性，另外CDR6基因還會被鉛誘導(dǎo)表達(dá)。這表明CDR6基因可能會參與鉛脅迫響應(yīng)。CDR6基因過量表達(dá)植株的獲得將有利于研究植物對重金屬的響應(yīng)機制，為改善土壤重金屬污染提供理論依據(jù)［10］。

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