產(chǎn)抗菌肽芽孢桿菌的發(fā)酵工藝研究

曹 丁，黃魁英，林創(chuàng)偉，夏楓耿，張高賢，張玲華

(1.廣州市微生物研究所，廣東廣州510663;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

抗菌肽又稱抗微生物肽，是指廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠抵抗外界病原菌侵害，具有多種免疫活性的先天性防御小分子多肽類物質(zhì)［1］。近年來由于濫用抗生素引發(fā)耐藥性菌株增加，又因禽畜制品的抗生素殘留問題嚴(yán)重危害人類健康，而抗菌肽由于特殊的抑菌機(jī)理不易耐藥，抗菌譜廣，使用安全性高，有望作為抗生素的替代品［2－3］。研究者將抗菌肽基因克隆于酵母中進(jìn)行表達(dá)，生產(chǎn)抗菌肽酵母制劑，用作畜禽及水產(chǎn)飼料添加劑，預(yù)防及治療動物疫?。?］。然而用酵母表達(dá)的抗菌肽不穩(wěn)定且效價偏低，自身耐受性差，易被蛋白酶降解，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本偏高，不易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其生產(chǎn)應(yīng)用［5］。

1985年，Bulla等［6］報道芽孢桿菌能產(chǎn)生多肽類的抗生素，這些抗菌肽包括Lleines、Bacitracins及Gramieidins等，它們都具有線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子量小，熱穩(wěn)定性好，含有D－氨基酸，能耐受蛋白酶的水解作用。目前，有關(guān)芽孢桿菌分泌的抗菌肽研究主要用于植物病害的防治，而用于防治人類、動物疾病的研究較少［7］。然而此類抗菌肽由于來源可靠，表達(dá)穩(wěn)定，無污染，低成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。但多數(shù)芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽組分較少，抗菌譜相對較窄，且產(chǎn)量較低，無法規(guī)模生產(chǎn)［8］。面對巨大的市場需求，開發(fā)高產(chǎn)量活性的抗菌肽芽孢桿菌制劑迫在眉睫。

該研究的抗菌肽是來源于一株枯草芽孢桿菌工程菌GL08，菌株綠色安全，無需誘導(dǎo)，可穩(wěn)定表達(dá)多種抗菌肽組分，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝后以提高效價，降低成本，從而實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。抗菌肽－芽孢桿菌制劑的研制成功將成為代替抗生素的新型飼料添加劑或生物肥料，具有較高的經(jīng)濟(jì)及社會價值。

1 材料與方法

1.1 供試菌 產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌GL08和大腸桿菌K12D31由廣州市微生物研究所提供。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，酵母抽提物20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加20 g/L的瓊脂粉。初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，氯化鈉 10 g/L，磷酸二氫鉀 0.8 g/L，七水合硫酸鎂 0.2 g/L，碳酸鈣 4 g/L，pH 6.7。效價檢測用培養(yǎng)基:NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，葡萄糖 5 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH 7.0。

酵母抽提物、胰蛋白胨:英國 Oxoid公司;瓊脂粉:廣州環(huán)凱生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DHZ－DA大容量全溫振蕩器:太倉市實驗設(shè)備廠;752N型紫外可見分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;50 L、500 L不銹鋼發(fā)酵罐:上海洋格生物設(shè)備有限公司。

1.4 GL08菌株搖瓶發(fā)酵 將斜面保存的GL08菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，然后以1%的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)過程分別取樣監(jiān)測各種生理指標(biāo)。

1.5 GL08菌株的500 L發(fā)酵罐中試試驗 將GL08菌種接種于種子培養(yǎng)基中，置于30℃、150 r/min培養(yǎng)20～24 h，待菌體長至穩(wěn)定期后再接種于50 L種子罐，同樣30℃培養(yǎng)8～9 h后，待菌體長至對數(shù)生長期中期時，過種到500 L發(fā)酵罐，每隔2 h取樣檢測發(fā)酵液的各項參數(shù)。

1.6 GL08菌株發(fā)酵過程各項生理指標(biāo)測定

1.6.1 菌體生物量測定。根據(jù)發(fā)酵液活菌數(shù)的對數(shù)值和吸光度成一定的線性關(guān)系原理，通過測定其在570 nm下的吸光度來間接反映菌體的生長情況。

1.6.2 pH測定。用PHS-25數(shù)顯酸度計測定。

1.6.3 還原糖測定。用3，5-二硝基水楊酸法測定。

1.6.4 殺菌效價測定。參照文獻(xiàn)［9］的方法，采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以大腸桿菌K12D31為指示菌，制備效價平板。然后用打孔器(直徑2.7 mm)打孔，每孔分別加入5 μl GL08菌株發(fā)酵上清，共3個平行板，每個平板重復(fù)3次，同時加入標(biāo)準(zhǔn)樣(標(biāo)定為1萬效價)對照，37℃培養(yǎng)14～16 h后，測定抑菌圈直徑。用此公式計算殺菌效價:殺菌效價(IU/ml)=2X×1 000 ×稀釋倍數(shù)，X=(抑菌直徑 －2.7)/2.1，樣品殺菌效價校正值=樣品殺菌效價實測值*10 000/標(biāo)準(zhǔn)品殺菌效價實測值。為減小不同測量批次之間的誤差，該研究中樣品的效價均為校正值。

2 結(jié)果與分析

2.1 GL08菌株搖瓶最佳發(fā)酵時間的確定 將GL08菌株接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于不同時間取樣檢測發(fā)酵上清的抑菌效價，結(jié)果見表1。

表1 GL08菌株在初始培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)時間的效價

由表1可知，GL08菌株在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h效價達(dá)到最高，之后逐漸下降，因此選擇24 h為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的終點。

2.2 GL08菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源。分別用20 g/L的可溶性淀粉、麥芽糊精、甘油、蔗糖、果糖和乳糖作為單一碳源替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余配方同初始發(fā)酵培養(yǎng)基，按“1.4”的方法接種培養(yǎng)，并取樣檢測效價等各指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，GL08菌株在蔗糖作為單一碳源的培養(yǎng)基中，抑菌效價最高(8 421 IU/ml)，考慮到葡萄糖作為速效碳源能迅速啟動菌體生長，為縮短發(fā)酵周期，故選擇葡萄糖與蔗糖搭配使用作為復(fù)合碳源。

2.2.2 最佳氮源。在篩選出合適碳源的基礎(chǔ)上，分別用30 g/L的國產(chǎn)蛋白胨、國產(chǎn)酵母浸膏、牛肉膏、黃豆餅粉、硫酸銨和干酪素分別替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的進(jìn)口蛋白胨和酵母抽提物作為單一氮源，其他成分相同，在搖瓶水平進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)試驗，并取樣檢測效價等各指標(biāo)，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，GL08在不同氮源中的抑菌效價差異很大，在無機(jī)氮源硫酸銨中長勢較差，效價也低，說明硫酸銨單獨使用并不能滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求。在國產(chǎn)酵母膏中的效價最高(9 468 IU/ml)，黃豆餅粉和初始培養(yǎng)基次之(分別為8 622和8 468 IU/ml)，但在黃豆餅粉中菌體長勢最好，考慮到國產(chǎn)酵母膏和黃豆餅粉價廉易得，因此選擇國產(chǎn)酵母膏和黃豆餅粉作為氮源搭配使用。

2.2.3 正交試驗優(yōu)化碳源和氮源的最佳配比。在單因素試驗確定了GL08菌株合適的碳源和氮源后，由于不同碳氮源之間具有交互作用，因此用4因素3水平正交表，以殺菌效價為指標(biāo)用來確定不同碳氮源之間的最佳配比，正交試驗設(shè)計見表2，每組發(fā)酵培養(yǎng)24 h后取樣檢測抑菌活性。

表2 正交試驗的因素水平 g/L

由表3可知，在GL08菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源中，對發(fā)酵上清殺菌效價的影響排序為國產(chǎn)酵母膏、葡萄糖、黃豆餅粉、蔗糖，即國產(chǎn)酵母膏的含量對抗菌肽產(chǎn)量影響最大，葡萄糖次之，從而得出優(yōu)化的最佳配方是葡萄糖30 g/L，蔗糖20 g/L，國產(chǎn)酵母膏30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，理論預(yù)測效價為14 518 IU/ml。在搖瓶中對優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗證，測得殺菌效價為14 023 IU/ml，與理論預(yù)測值接近，比正交試驗效價最高的第8組略高。

2.2.4 最佳發(fā)酵配方的中試驗證及GL08菌株的生長特性。按照優(yōu)化后GL08菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，將GL08搖瓶種子于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，按3%的接種量接種于50 L種子罐中，經(jīng)過二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，在500 L的發(fā)酵罐中以同樣的工藝條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并用初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，驗證優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵水平。GL08菌株在500 L發(fā)酵罐中，從接種開始，每隔1～2 h取樣測定發(fā)酵液的pH、OD570、抑菌效價和還原糖含量，結(jié)果見圖3、4。

表3 GL08發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗結(jié)果

從圖3可以看出，GL08菌株在500 L發(fā)酵罐的初始培養(yǎng)基中，經(jīng)過短暫的延滯期，從第2 h起開始生長，可能是因為接種量大，且發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基營養(yǎng)成分接近。2～8 h為對數(shù)生長期，到8 h后經(jīng)過短暫的穩(wěn)定期后，迅速進(jìn)入衰亡期，OD570值下降趨勢明顯。殺菌效價的變化趨勢與菌體生物量的變化趨勢大體一致，隨著菌體的生長，抗菌肽逐步產(chǎn)生，在發(fā)酵過程中，抗菌肽的產(chǎn)生量與生物量呈正相關(guān)，到8 h菌體的生物量達(dá)到最大(OD570=12.16)，抗菌肽的效價也達(dá)到最大為8 035 IU/ml，從第9 h起，菌體開始衰亡自溶，OD570值迅速下降，抗菌肽的效價也隨之下降。pH在整個發(fā)酵過程中，剛開始隨菌體生長而有所下降，從9 h起一直到發(fā)酵結(jié)束，pH開始逐步上升。說明發(fā)酵液pH上升，效價和OD570下降的時間點是一致的，此時間點即為放罐的最佳時間。

從圖4可以看出，GL08菌株在500 L發(fā)酵罐的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，從第4 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，8 h OD570達(dá)到最高，之后開始緩慢下降，菌體進(jìn)入衰亡期。在發(fā)酵初期，發(fā)酵液的殺菌效價隨著菌體的生長緩慢增長，8～14 h效價高速增長，到14 h達(dá)到最高，之后保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。GL08菌株在整個發(fā)酵過程中pH維持在5～6，變化趨勢不明顯。由此可知，GL08菌株是在穩(wěn)定期大量產(chǎn)生抗菌肽，OD570達(dá)到最高點約6 h后，效價達(dá)到最高為15 311 IU/ml，之后相對穩(wěn)定，此時可以結(jié)束培養(yǎng)。

由此可知，GL08菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中，效價大幅提高。在相同培養(yǎng)基中500 L發(fā)酵罐的菌體生物量和效價都比搖瓶有所提高，這可能是因為發(fā)酵罐的通風(fēng)和攪拌更利于物質(zhì)傳遞，產(chǎn)生更高的溶氧，更有利于菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成。在500 L發(fā)酵罐中，抗菌肽在初始培養(yǎng)基中效價為8 035 IU/ml，在優(yōu)化培養(yǎng)基中的效價為15 311 IU/ml，與初始培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后的培養(yǎng)基效價提高約90%，且抗菌肽在發(fā)酵后期的穩(wěn)定性也得到提高。

3 結(jié)論與討論

該研究以枯草芽孢桿菌GL08為研究對象，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化了高效表達(dá)抗菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖30 g/L，蔗糖20 g/L，國產(chǎn)酵母膏30 g/L，黃豆餅粉10 g/L，氯化鈉10 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，碳酸鈣4 g/L，優(yōu)化后搖瓶的殺菌效價為14 023 IU/ml，比優(yōu)化前提高了一倍。并在500 L中試規(guī)模水平上對優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了驗證，通過觀察比較GL08菌株在初始培養(yǎng)基和優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長特性，發(fā)現(xiàn)抗菌肽在優(yōu)化培養(yǎng)基中的效價為15 311 IU/ml，與初始培養(yǎng)基效價8 035 IU/ml相比提高約90%。此外，優(yōu)化后的培養(yǎng)基用廉價易得的國產(chǎn)組分代替昂貴的進(jìn)口成分，使生產(chǎn)成本大大降低，且抗菌肽在發(fā)酵后期的穩(wěn)定性也得到提高。

綜上所述，該生產(chǎn)工藝調(diào)控簡單，成本低，發(fā)酵周期短，且表達(dá)穩(wěn)定，具有較高的實際應(yīng)用價值。該研究在500 L中試水平進(jìn)行了多次發(fā)酵試驗，研究了GL08菌株分泌表達(dá)抗菌肽的各項指標(biāo)，初步掌握了其生長特性，為后期進(jìn)一步研究抗菌肽的中試調(diào)控工藝提供了參考，并為抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］NAKATSUJI T，GALLO R L.Antimicrobial peptides:old molecules with new ideas［J］.J Invest Dermatol，2012，132(3 Pt 2):887 －895.

［2］汪以真，韓新燕，許梓榮.哺乳動物抗菌肽及其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用前景［J］.中國畜牧雜志，2002，38(4):52 －54.

［3］王志強(qiáng)，張愛忠，姜寧，等.抗菌肽在畜牧業(yè)上的應(yīng)用研究及問題分析［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2013(5):21 －26.

［4］梁潔，李運(yùn)南，董加喜.抗茵肽飼喂肉雞的應(yīng)用研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009(4):416 －419.

［5］李敏惠，楊平，何正波.昆蟲抗菌肽及其基因工程研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12(3):437 －440.

［6］BULLA L A JR，HOCH J A.Biology of the Bacilli［M］//DEMAIN A L，SOLOMON N A.Biology of in dustrial microorganisms.Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif，1985:57 －58.

［7］趙朋超，王建華，權(quán)春善，等.枯草芽孢桿菌抗菌肽生物合成的研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2010，30(10):108 －113.

［8］馬文山，廖富蘋，范雪云.細(xì)菌抗菌肽的研究進(jìn)展及其應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報，2008(3):39－46.

［9］梁潔，彭中鍵，梁淑娃，等.轉(zhuǎn)基因酵母菌深層發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(6):639 －640.