肇慶地區(qū)柑橘內(nèi)生菌16S rDNA克隆與序列分析

穆曉琨，李充璧，高飛云，王 玨(肇慶學(xué)院生物醫(yī)藥工程中心，廣東肇慶526061)

柑橘是世界第一大水果，主要分布在35°N以南的區(qū)域，性喜溫暖濕潤，有大水體增溫的地域可向北推至45°N。世界上有135個國家生產(chǎn)柑橘，年產(chǎn)量10 282.2萬t，面積715.3萬 hm2，均居百果之首，產(chǎn)量第 1位的是巴西，為2 425.26萬 t，第2 位美國，為1 633.52 萬t，中國第3，為1 078萬 t，再后是墨西哥、西班牙、伊朗、印度、意大利等國［1］。

柑橘黃龍病是一種世界范圍內(nèi)的柑橘毀滅性病害，該病最早在我國被發(fā)現(xiàn)后的近100年間，已廣泛分布于亞洲、非洲和美洲等地的國家和地區(qū)。黃龍病能侵染各種柑橘類植物，病樹主要表現(xiàn)為經(jīng)濟壽命短，產(chǎn)量低，果品質(zhì)劣，引起巨大的經(jīng)濟損失。柑橘樹的經(jīng)濟壽命原來可達幾十年，乃至上百年，但受黃龍病危害之后，柑橘樹的壽命大大縮短，僅有10年左右。黃龍病曾給東南亞以及我國的廣東、廣西和福建3省區(qū)的柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴重影響，近年來該病害又有卷土重來之勢［2］。

黃龍病的病原物尚不能人工培養(yǎng)，目前普遍認為原核生物薄壁菌門變形菌綱(Proteobacteria)α-變型菌綱(Alphaproteobaeteriacea)根瘤菌目(Rhizobiales)α-根瘤菌科(Rhizobiaceae)韌皮部桿菌屬(Candidatus Libefibaeter)是引起黃龍病的主要病原。柑橘黃龍病無特效抑制劑，也沒有抗(耐)病品種可供應(yīng)用。因此，只有通過嚴格地進行檢疫措施、使用無病苗木、及時挖除病樹，以及系統(tǒng)、全面地防治木虱是目前防治黃龍病最有效的方法［3］。

16S rDNA是原核生物分類中最常用和最有效的方法［4］。16S rDNA序列具有高度保守性，可以用來精確鑒定原核生物之間的親緣關(guān)系，其所蘊含的信息能反映生物界的進化關(guān)系［5］。通過比較其所特有的16S rDNA序列間的同源性差異程度可以判斷種屬及親緣關(guān)系，在原核生物的鑒定和分析方面具有重要地位［6］。

為了更好地對黃龍病病原及其分化進行研究，筆者運用PCR技術(shù)對從我國廣東省肇慶地區(qū)高要、四會、廣寧、封開、懷集5個市縣采集的40多個黃龍病感染柑橘樣品進行了菌種的分離、純化和保存，然后對其16S rDNA序列進行PCR擴增、克隆和DNA測序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1 材料與方法

1.1 材料 柑橘黃龍病植株內(nèi)生菌來自肇慶地區(qū)，實驗室分離?？寺∮么竽c桿菌菌種E.coli TGI、質(zhì)粒由肇慶學(xué)院生物醫(yī)藥工程中心保存;克隆載體pMD18-T Vector購自TaKa-Ra公司。

1.2 方法

1.2.1 柑橘內(nèi)生菌分離。①從懷寧、廣寧等地的柑橘果園，取回?zé)o病植株和有病植株的枝葉及土壤，按照常規(guī)細菌分離方法進行內(nèi)生菌分離。②細菌培養(yǎng)。將取自患有黃龍病的柑橘枝、葉部分分離出的病原細菌接入到含有LB培養(yǎng)液的試管中活化、恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 16S rDNA克隆。①細菌DNA提取。將來源肇慶不同地區(qū)的柑橘內(nèi)生菌基因組DNA進行提取，按照北京天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟進行。②DNA定量?？瞻讓φ諡?50 μl ddH2O，吸取樣本1 μl加入250 μl ddH2O在紫外分光計上測定A260和A280，可得到DNA濃度，進而粗略估計樣品純度。③PCR擴增16S rDNA。設(shè)計細菌的通用PCR引物27F:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3';1429R:5'TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 3'。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃ 保存。以從肇慶周邊各區(qū)縣疑似患有黃龍病的柑橘枝和葉中所分離出的內(nèi)生菌16S rDNA為模板，用上述引物進行PCR擴增。④電泳檢測16S rDNA片段。⑤目的基因克隆。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體16℃下連接過夜后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α中，涂布于含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑選白色菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。

1.2.3 基因序列測定。菌液PCR鑒定后，將篩選的陽性單菌落送至南方基因組中心測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA片段分離 從柑橘黃龍病植株中分離出內(nèi)生真菌40株，細菌20株。從細菌中提取出DNA進行PCR擴增，結(jié)果擴增出1 261 nt的16S rDNA片段(圖1)。

2.2 序列分析 經(jīng)序列測定發(fā)現(xiàn)，從不同地區(qū)柑橘黃龍病植株中分離到的內(nèi)生菌在健康株中也存在1 261 nt的16S rDNA片段。通過序列分析，可以推測該內(nèi)生菌與眾多的未能培養(yǎng)的細菌(Uncultured bacterium)都有極高的相似度，其中的測序結(jié)果在同源性檢測中，與其相似度最高的是Uncultured bacterium clone yf5-180，達到91.3%。說明此序列是一個較新的序列，是一種與已知細菌種類不同的細菌，因為目前尚未見柑橘黃龍病病原分離培養(yǎng)的報道，也沒有明確確定柑橘黃龍病的病原菌是何種細菌，此種細菌極有可能就是柑橘黃龍病的致病菌。序列測定結(jié)果見圖2。

序列分析可知，在NCBI數(shù)據(jù)庫的同源性對比中，同源性達到90.5% ～91.3%是未能夠培養(yǎng)的細菌 Uncultered candidated bacterGS242.seq 和 Uncultured bacterium clone yf5-180 16S ribosomal RNA gene，同源性相差3%，即可認為是不同種(表1)。

表1 核苷酸序列同源性分析

2.3 進化樹分析 分子進化樹分析表明，該內(nèi)生菌的16S rDNA親緣關(guān)系與未能培養(yǎng)的細菌(Uncultured bacterium)更接近(圖3)。

由圖3可知，各菌株的同源性都在81.0%以上，最高達91.3%。目前已知細菌和植原體16SrDNA基因只要相差3%以上則可定為不同的種。與該內(nèi)生菌同源性最高的是未能夠培養(yǎng)細菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5-180，達到 90.5% ～91.3%，故可認為該內(nèi)生菌雖然與未能培養(yǎng)的細菌(Uncultured bacterium)的親緣關(guān)系較為接近，但該內(nèi)生菌應(yīng)該屬于一個新的菌株。

3 結(jié)論與討論

未能培養(yǎng)的細菌(Uncultured bacterium)主要是指尚未能夠完全分離培養(yǎng)的細菌。因為目前還沒有成功分離培養(yǎng)柑橘黃龍病病原的報道。研究表明，未能培養(yǎng)的細菌在柑橘黃龍病的內(nèi)生菌所占比例大于5%［7］，該內(nèi)生菌可能為柑橘黃龍病的病原菌。16S rDNA存在于所有原核生物的細胞中，它是研究細菌分類、進化和親緣關(guān)系的重要指標，可用于進化程度不同的生物系統(tǒng)發(fā)育研究，特別對于不能進行人工培養(yǎng)的細菌，利用其進行分類是一個有力的工具。目前已知細菌和植原體16S rDNA基因只要相差3%以上則可定為不同的種［8］。

該研究運用分子生物學(xué)的方法對廣東肇慶地區(qū)柑橘黃龍病植株體的16S rDNA進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行克隆、序列測定及同源關(guān)系分析，確定了該植株的分類地位。目前，國內(nèi)外學(xué)者對柑橘黃龍病植株病原進行了大量研究，以期為柑橘黃龍病的防治提供參考依據(jù)。從該研究擴增到的肇慶柑橘黃龍病植原體16S rDNA基因中發(fā)現(xiàn)一個特殊的序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫的同源性對比中，與其相似度最高的是Uncultered candidated bacterGS242.seq 和 Uncultured bacterium clone yf5-180，達到90.5% ～91.3%。同源性相差3%，即可認為是不同種。盡管有研究利用含有柑橘葉脈提取物的培養(yǎng)基能成功培養(yǎng)出亞洲種黃龍病病原菌，并完成其柯赫氏法則驗證的報道［9］，但該試驗為孤例，尚無重復(fù)成功的報道［9］。除了個例，目前還沒有成功分離培養(yǎng)柑桔黃龍病病原的報道，所以該研究發(fā)現(xiàn)了一個尚未發(fā)現(xiàn)的細菌種屬。此細菌很有可能是柑橘黃龍病的病原菌。對于此細菌的研究是一個較為有價值的課題。

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