維甲酸X受體在雜色鮑性腺發(fā)育中的調(diào)控作用研究

王鑫，王淑紅(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門361021)

性別決定與性腺發(fā)育一直都是現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一，它們是彼此緊密聯(lián)系的2個(gè)過程:性別決定首先確定了個(gè)體性腺發(fā)育的方向，性腺發(fā)育在性腺分化的基礎(chǔ)上，經(jīng)過遺傳、環(huán)境、生理等因素復(fù)雜的相互作用，最終發(fā)育成成熟的精巢和卵巢［1］。性別決定與性腺發(fā)育的作用機(jī)制可以歸納成2種類型:一類為遺傳決定系統(tǒng)(Genetic sex-determination system，GSD)，即由遺傳因素決定性別，主要指性染色體和性別決定基因的調(diào)控;另一類為環(huán)境決定系統(tǒng)(Environmental sex-determination system，ESD)，即周圍環(huán)境因子的調(diào)控，主要是性激素、環(huán)境因子等外部因素的作用。軟體動(dòng)物性別決定與性腺發(fā)育的分子機(jī)制尚未明確，該過程相關(guān)的基因也尚未得到證實(shí)［2－6］，加上絕大多數(shù)軟體動(dòng)物尚未發(fā)現(xiàn)性染色體和性別決定基因，因此軟體動(dòng)物性腺發(fā)育的作用分子機(jī)制可能是環(huán)境決定系統(tǒng)。

在20世紀(jì)，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)性激素包括雌二醇、睪酮和孕酮廣泛存在于腹足類［6－8］和雙殼類［9－10］等軟體動(dòng)物中。Osada等［11］和Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)在雙殼類生物體內(nèi)注射雌二醇能促進(jìn)卵黃的生成并調(diào)節(jié)排卵過程。Varaksina等［13］報(bào)道在蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)體內(nèi)注射雌二醇、睪酮和孕酮后能刺激成體樣品的卵子發(fā)生和精子發(fā)生，導(dǎo)致卵母細(xì)胞直徑的增長以及性腺重量的增加。但是，Scott［3－4］綜述了200多篇主張軟體動(dòng)物存在脊椎動(dòng)物類型類固醇激素觀點(diǎn)的學(xué)術(shù)論文，指出目前沒有確切證據(jù)表明軟體動(dòng)物能夠合成脊椎動(dòng)物類型的類固醇激素。因此，盡管軟體動(dòng)物體內(nèi)存在類似于脊椎動(dòng)物的雌激素和雄激素，但由于缺乏對其生物合成途徑或來源的了解以及有關(guān)激素受體的直接證據(jù)，脊椎動(dòng)物類型的類固醇激素在軟體動(dòng)物性腺分化中的作用仍是一個(gè)未解之謎。

維甲酸X受體是核受體家族重要的組成成員，其主要功能是作為轉(zhuǎn)錄因子來參與生物發(fā)育、細(xì)胞分化、新陳代謝以及細(xì)胞凋亡過程。RXR還是孤兒受體家族的一員，目前還沒有找到RXR的天然配體。軟體動(dòng)物RXR基因的相關(guān)研究已經(jīng)越來越受到重視。2004年，Nishikawa等［14］研究發(fā)現(xiàn)TBT與TPT能改變?nèi)薘XR的表達(dá)水平;Castro等［15］在對狗巖螺的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)性畸變的誘導(dǎo)是由RXR信號途徑調(diào)控的。2011年，Horiguchi等［16］向疣荔枝螺注射了9cRA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TcRXR的mRNA水平在性畸變個(gè)體的陰莖和輸精管顯著上升，這說明RXR參與了有機(jī)錫致疣荔枝螺性畸變的過程。這表明RXR基因確實(shí)參與了TBT等有機(jī)錫化合物調(diào)控軟體動(dòng)物性腺發(fā)育的過程。

雜色鮑(Haliotis diversicolor)，屬于腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)、鮑屬(Haliotis)，是我國南方重要經(jīng)濟(jì)貝類之一，闡明雜色鮑性腺發(fā)育的分子機(jī)制對于雜色鮑的健康養(yǎng)殖有著重要的意義。筆者以雜色鮑為研究對象，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育不同階段的表達(dá)情況，確認(rèn)雜色鮑性腺分化的關(guān)鍵窗口期。然后，采用RNA干擾技術(shù)，在雜色鮑性腺分化的關(guān)鍵時(shí)期沉默RXR基因、RXR基因以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因在雜色鮑性腺分化與發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用雜色鮑購自于廈門市翔安區(qū)培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖公司并放養(yǎng)在培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，每天都由養(yǎng)殖公司工作人員喂養(yǎng)新鮮江蘺(Gracilaria verrucosa)，海水溫度控制在25℃左右。每月解剖樣本時(shí)挑選重量一致、附著力強(qiáng)的健康鮑魚。解剖鮑魚時(shí)，分別采集頭部組織、肝胰腺組織以及性腺組織，液氮速凍后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 dsRNA的合成 以Trizol法提取雜色鮑總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到的線性化cDNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增了雜色鮑RXR基因的干擾片段，然后通過目的基因與質(zhì)粒載體連接、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和篩選、質(zhì)粒插入片段的檢測、質(zhì)粒測序等步驟制備得到合成dsRNA所需的線性化DNA。采用體外轉(zhuǎn)錄法合成dsRNA。0．5 ml PCR管加入以下反應(yīng)體系:1 μg 線性化的 DNA、20 μl 10 × 轉(zhuǎn)錄緩沖液、10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 10 mmol/L CTP、10 μl 10 mmol/L GTP、10 μl 10 mmol/L UTP、1 μl RNase inhibitor、2 μl RNA polymerase、5 μl 0．1 mol/L DTT，加入 DEPC 水至 100 μl。試驗(yàn)完成后，取少量樣品用1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的質(zhì)量，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)檢測dsRNA的濃度。剩余的樣品加入1 μl RNase inhibitor，－80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 RNA干擾試驗(yàn) 將暫養(yǎng)7 d的雜色鮑分成3組:第1組在鮑魚肝胰腺的中間部位注射1．5 μg/b．w．的滅菌海水;第2組在鮑魚肝胰腺的中間部位注射1．5 μg/b．w．的dsRNA-EGFP;鮑魚肝胰腺的中間部位注射 1．5 μg/b．w．的 dsRNA-RXR。注射完成后將鮑魚放回之前的缸中放養(yǎng)。48 h后解剖鮑魚進(jìn)行RNA提取。

1．4 實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn) 實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)體系(10 μl):SYBR Green PCR Master Mix 5 μl、上游引物 F 0．5 μl、下游引物 R 0．5 μl、cDNA 模板 4 μl。

實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)熱5 min;95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán);最后，進(jìn)行溶解曲線分析:95℃ 5 s，65℃ 1 min，從65℃升溫至97℃(每10 s上升0．11 ℃)。

定量的結(jié)果采用 LightCycler?480Software1．5分析，運(yùn)用Pfaff法(RQ=(1+E)△Cq，△Cq=最小的Cq值分別減去各組織樣本的Cq值，E為不同基因引物的擴(kuò)增效率)，并使用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用RQ值表示基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2．1 雜色鮑卵巢發(fā)育過程中RXR的表達(dá)變化 根據(jù)前期對雜色鮑性腺石蠟切片的顯微鏡觀察結(jié)果(性腺的顏色、體積、生殖細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及占主體的生殖細(xì)胞的類型等)，將雜色鮑的性腺發(fā)育周期分為4個(gè)時(shí)期:休止期、增殖期、生長期、成熟期。根據(jù)前期對雜色鮑卵巢內(nèi)參基因的篩選，將OAZ1作為卵巢內(nèi)基因相對表達(dá)的最適內(nèi)參。

從圖1可以看出，在卵巢組織中RXR基因在性腺發(fā)育增殖期和生長期的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0．05);此后，在性腺發(fā)育成熟期和休止期的表達(dá)量顯著下調(diào)。在雌性雜色鮑頭部組織中，RXR基因在性腺發(fā)育的增殖期表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育生長期、成熟期和休止期表達(dá)量顯著下調(diào)。在雌性雜色鮑肝胰腺組織，RXR在性腺發(fā)育的增殖期時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育生長期、成熟期和休止期時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)。在雄性雜色鮑頭部組織，RXR基因在性腺發(fā)育的增殖期時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育生長期、成熟期和休止期時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)。在雄性雜色鮑肝胰腺組織中，RXR基因在性腺發(fā)育生長期的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0．05);在性腺發(fā)育成熟期時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá);在性腺發(fā)育休止期時(shí)表達(dá)量呈上升趨勢;在性腺發(fā)育增殖期，表達(dá)量顯著下調(diào)。

2．2 RXR基因的RNA干擾結(jié)果 為了檢測RXR基因沉默對雌性雜色鮑RXR基因的表達(dá)的影響，利用熒光定量PCR技術(shù)分析RXR基因沉默后樣品中RXR基因的mRNA表達(dá)水平。從圖2可以看出，在雌性個(gè)體頭部組織中，處理組RXR基因表達(dá)水平與空白對照組以及陰性對照組相比無顯著性差異。從圖3可以看出，在雌性個(gè)體卵巢組織中，處理組RXR基因表達(dá)水平與空白對照組以及陰性對照組相比顯著性下降(P ＜0．05)。

3 討論

在脊椎動(dòng)物中，RXR基因參與多種重要的生理過程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、新陳代謝等。脊椎動(dòng)物體內(nèi)的RXR有3種亞型(α、β、γ)，能夠與維生素D受體、甲狀腺激素受體、過氧化物酶體增殖物激活受體、膽汁酸受體等核受體形成異源二聚體發(fā)揮調(diào)控作用［17］。在甲殼類動(dòng)物體內(nèi)，RXR基因能與蛻皮激素形成異源二聚體［18］。目前，關(guān)于軟體動(dòng)物RXR基因的研究主要集中在TBT等有機(jī)錫化合物誘導(dǎo)RXR的非正常表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致性畸變現(xiàn)象［19］。在性畸變后期，由于卵巢內(nèi)輸精管的產(chǎn)生導(dǎo)致輸卵管阻塞以及卵巢內(nèi)的精子發(fā)生，受到性畸變影響的軟體動(dòng)物都會(huì)出現(xiàn)性腺發(fā)育不良的現(xiàn)象，進(jìn)而出現(xiàn)種族繁育危機(jī)［20－22］。筆者主要研究RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育過程中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RXR在卵巢、雌性個(gè)體頭部組織、雌性個(gè)體肝胰腺組織、雄性個(gè)體頭組織和雌性個(gè)體肝胰腺組織的表達(dá)量在增殖期均存在顯著差異，這證實(shí)了RXR不僅在脊椎動(dòng)物體內(nèi)參與了細(xì)胞增值與分化的過程，在軟體動(dòng)物體內(nèi)同樣存在該作用，同時(shí)也表明增殖期可能是RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育過程中起調(diào)控作用的的窗口期，為后面的RNA干擾試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，在雄性個(gè)體肝胰腺組織，RXR基因在性腺發(fā)育增殖期時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)，這與其他組織的表達(dá)情況不同，說明在雄性雜色鮑體內(nèi)RXR基因在不同組織發(fā)揮調(diào)控作用的時(shí)間點(diǎn)不同，也可能RXR基因在性腺發(fā)育過程中有其他作用。

RNA干擾技術(shù)能夠快速有效沉默某個(gè)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響該基因的功能作用。目前，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在脊椎動(dòng)物與非脊椎動(dòng)物中。但是，在軟體動(dòng)物中，這項(xiàng)技術(shù)還處于初步完善的階段。有些腹足類生物神經(jīng)系統(tǒng)的研究和頭足類觸手肌肉的分化的研究已經(jīng)使用該項(xiàng)技術(shù);對于雙殼類生物，F(xiàn)abioux等［5］通過對牡蠣性腺注射vasa-like雙鏈RNA，結(jié)果表明注射后的牡蠣生殖細(xì)胞不在分化并且過早的出現(xiàn)減數(shù)分裂過程，甚至出現(xiàn)不育現(xiàn)象。筆者通過對雌性雜色鮑肝胰腺中間部位注射RXR雙鏈RNA來檢測RXR基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在雌性個(gè)體頭部組織中處理組RXR基因表達(dá)水平與空白對照組以及陰性對照組相比無顯著性差異;在雌性個(gè)體卵巢組織中，處理組RXR基因表達(dá)水平同空白對照組以及陰性對照組相比顯著性下降(P＜0．05)。在卵巢中RXR基因表達(dá)的顯著性下調(diào)，說明RXR雙鏈RNA體外注射能有效沉默卵巢中RXR基因的表達(dá);雌性個(gè)體頭部組織中的RXR表達(dá)量沒有變化可能有2個(gè)方面的原因:注射到取樣間隔時(shí)間(48 h)較短，以至于沉默效果還未在雌性個(gè)體頭部組織中發(fā)揮作用，或者是因?yàn)镽XR雙鏈RNA在未到達(dá)目的組織的時(shí)候已經(jīng)被降解。

綜上所述，筆者研究了RXR基因在雜色鮑性腺發(fā)育中的周年表達(dá)情況。這些研究結(jié)果有助于闡明雜色鮑性腺發(fā)育的分子機(jī)制，進(jìn)一步豐富了軟體動(dòng)物繁殖生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)的知識，并為軟體動(dòng)物的性腺分化與發(fā)育分子機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。

［1］周林燕，張修月，王德壽．脊椎動(dòng)物性別決定和分化的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］．動(dòng)物學(xué)研究，2004，25(1):81 －88．

［2］ZHOU J，CAI Z．Molecular cloning and characterization of prohormone convertase 1 gene in abalone(haliotis diversicolor supertexta)［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2010，155(3):331 －339．

［3］SCOTT A P．Do mollusks use vertebrate sex steroids as reproductive hormones?Part I:Critical appraisal of the evidence for the presence，biosynthesis and uptake of steroids［J］．Steroids，2012，77(13):1450 －1468．

［4］SCOTT A P．Do mollusks use vertebrate sex steroids as reproductive hormones?II．critical review of the evidence that steroids have biological effects［J］．Steroids，2013，78(2):268 －281．

［5］FABIOUX C，CORPOREAU C，QUILLIEN V，et al．In vivo RNA interference in oyster-vasa silencing inhibits germ cell development［J］．Febs Journal，2009，276(9):2566 －2573．

［6］HUVET A，F(xiàn)LEURY E，CORPOREAU C，et al．In vivo RNA interference of a gonad-specific transforming growth factor-β in the pacific oyster crassostrea gigas［J］．Marine Biotechnology，2012，14(4):402 －410．

［7］GOTTFRIED H，DORFMAN R，WALL P．Steroids of invertebrates:Production of oestrogens by an accessory reproductive tissue of the slug arion ater rufus(linn．)［J］．Nauture，1967，215(1):409 －410．

［8］LE GUELLEC D，THIARD M，REMY －MARTIN J P，et al．In vitro metabolism of androstenedione and identification of endogenous steroids in helix aspersa［J］．General and Comparative Endocrinology，1987，66(3):425 －433．

［9］SALIOT A，BARBIER M．Isolation of progesterone and several ketosteroids of the female part of the gonads of the scallop pecten maximus［J］．Biochimie，1971，53(2):265．

［10］MATSUMOTO T，OSADA M，OSAWA Y，et al．Gonadal estrogen profile and immunohistochemical localization of steroidogenic enzymes in the oyster and scallop during sexual maturation［J］．Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，1997，118(4):811 －817．

［11］OSADA M，MORI K，NOMURA T．In vitro effects of estrogen and serotonin on release of eggs from the ovary of the scallop［patinopecten Yessoensis］．［J］．Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1992，67(1):111 －118．

［12］LI Q，OSADA M，SUZUKI T，et al．Changes in vitellin during oogenesis and effect of estradiol-17β on vitellogenesis in the pacific oyster crassostrea gigas［J］．Invertebrate Reproduction ＆ Development，1998，33(1):87－93．

［13］VARAKSINA G，VARAKSIN A．Effect of estradiol，progesterone and testosterone on oogenesis of the japanese scallop mizuhopecten-yessoensis［J］．Biologiya Morya －marine Biology，1991，215(3):61 －68．

［14］NISHIKAWA J，MAMIYA S，KANAYAMA T，et al．Involvement of the retinoid X receptor in the development of imposex caused by organotins in gastropods［J］．Environmental Science ＆ Technology，2004，38(23):6271－6276．

［15］CASTRO L F C，LIMA D，MACHADO A，et al．Imposex induction is mediated through the retinoid X receptor signalling pathway in the neogastropod nucella lapillus［J］．Aquatic Toxicology，2007，85(1):57 －66．

［16］HORIGUCHI T，NISHIKAWA T，OHTA Y，et al．Retinoid X receptor gene expression and protein content in tissues of the rock shell thais clavigera［J］．Aquatic Toxicology，2007，84(3):379 －388．

［17］WOLF G．Is 9-cis-retinoic acid the endogenous ligand for the retinoic acid-x receptor?［J］．Nutrition Reviews，2006，64(12):532 －538．

［18］DURICA D S，WU X，ANILKUMAR G，et al．Characterization of crab ecr and Rxr homologs and expression during limb regeneration and oocyte maturation［J］．Molecular and Cellular Endocrinology，2002，189(1):59 －76．

［19］WANG Y H，LEBLANC G A．Interactions of methyl farnesoate and related compounds with a crustacean retinoid X receptor［J］．Molecular and Cellular Endocrinology，2009，309(1):109 －116．

［20］GIBBS P，BRYAN G．Reproductive failure in populations of the dogwhelk，nucella lapillus，caused by imposex induced by tributyltin from antifouling paints［J］．Journal of the Marine Biological Association of the U-nited Kingdom，1986，66(4):767 －777．

［21］BRYAN G，GIBBS P，BURT G．A Comparison of the effectiveness of trin-butyltin chloride and five other organotin compounds in promoting the development of imposex in the dog-whelk，nucella lapillus［J］．Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom，1988，68(4):733－744．

［22］HORIGUCHI T，KOJIMA M，HAMADA F，et al．Impact of tributyltin and triphenyltin on ivory shell(babylonia Japonica)populations［J］．Environmental Health Perspectives，2006，114(S1):13．