黃瓜霜霉病生防菌株的篩選及防病促生研究

黃瓜霜霉病生防菌株的篩選及防病促生研究

陳穎瀟1，何 胥2，施潔君3，張麗娜1，谷 春2，王 光2，郭堅華1*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系，江蘇南京 210095；2.江蘇省安豐生物源農(nóng)藥工程中心有限公司，江蘇太倉 215400；3.江蘇省太倉市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇太倉 215400)

摘要[目的]篩選黃瓜霜霉病的生防菌株, 為黃瓜霜霉病的生物防治和生防菌制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。[方法]通過溫室試驗和大田試驗研究生防菌株對黃瓜霜霉病的防效以及對黃瓜的促生作用。[結(jié)果]溫室試驗結(jié)果表明，人工接種霜霉病病原菌20 d后，34株細(xì)菌中有7株對黃瓜霜霉病的防治效果在50%以上，其中TDGN2的防治效果最好，防效達(dá)到64.65%；有7個菌株對黃瓜苗生物量的增加量超過20%。大田試驗結(jié)果表明，溫室條件下防效和促生效果較好的DS22、TDJN4和THGB4 3個菌株中TDJN4對黃瓜霜霉病的防效均超過50%；生防菌株處理的黃瓜葉綠素總含量均顯著高于清水對照。[結(jié)論]生防菌株TDJN4對黃瓜霜霉病表現(xiàn)出一定的防病促生效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞黃瓜霜霉病；生防菌株；防效；促生

中圖分類號S436.421.1+1

基金項目蘇州科技支撐計劃項目(SNG201232)。

作者簡介陳穎瀟和何胥為共同貢獻(xiàn)作者。陳穎瀟(1990- )，男，江蘇溧陽人，碩士，從事植物病害生物防治研究。何胥(1987- )，男，江蘇宜興人，助理農(nóng)藝師，從事作物栽培技術(shù)研究。*通訊作者，教授，從事植物病害生物防治研究。

收稿日期2015-06-11

Screening of Biocontrol Strain against Cucumber Downy Mildew and the Preliminary Study of Disease Prevention and Hygiene Promotion

CHEN Ying-xiao1, HE Xv2, SHI Jie-jun3, GUO Jian-hua1*et al(1. Plant Pathological System, College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095; 2. Jiangsu Ann and Bio-source Pesticide Engineering Center Co., Ltd., Taicang, Jiangsu 215400;3.Taicang Agriculture Committee,Taicang,Jiangsu 215400)

Abstract[Objective] Biocontrol strains against cucumber downy mildew were screened out to lay the basis for biological control of Pseudoperonospora cubensis on cucumber and development of biological agents. [Method] Control efficiency and growth-promoting effects of biocontrol strains of cucumber downy mildew were studied through greenhouse and field experiments. [Result] Greenhouse experiment results showed that after the artificial was inoculated into downy mildew pathogen for 20 d, 7 of 34 strains of bacteria could control cucumber downy mildew more than 50%, among them TDGN2 had the best prevention, and its control efficiency reached 64.65%. There were seven strains of cucumber seedlings to increase biomass volume more than 20%. Field test results showed that TDJN4 had cucumber downy mildew control effect more than 50%; the total chlorophyll content of cucumber biocontrol strains were significantly higher than those treated water treatment. [Conclusion] TDJN4 had great effects on disease prevention and growth-promoting against cucumber downy mildew, it would have a broad application prospect in the future.

Key wordsPseudoperonosporacubensison cucumber; Biocontrol strain; Biocontrol efficiency; Plant-growth promotion

黃瓜霜霉病是由古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk．&Curt．)Rostov]引起的一種氣傳病害，是世界黃瓜生產(chǎn)區(qū)的重要葉部病害之一[1]，也是保護(hù)地黃瓜上的一種毀滅性病害，有70多個國家先后發(fā)生過該病害[2]。近年來，隨著保護(hù)地黃瓜種植面積的不斷增加，黃瓜霜霉病的危害逐年加重，現(xiàn)已成為制約溫室大棚黃瓜產(chǎn)量的重要因子。種植抗病品種[3]和使用化學(xué)藥劑是目前防治該病害的主要方法，但是抗病育種工作周期長，化學(xué)藥劑的反復(fù)使用易產(chǎn)生抗藥性[4]且污染環(huán)境。因此，生物防治策略成為該病害防治研究的新方向。筆者從前期初步篩選的菌株中選取34個菌株，通過溫室試驗和大田試驗對其防治效果、促生作用進(jìn)行了評價，旨在為該病的生物防治和生防菌制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料34個供試菌株均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系生物源農(nóng)藥研發(fā)試驗室和江蘇省安豐生物源農(nóng)藥工程中心有限公司共同篩選。供試植株為黃瓜霜霉病中抗品種“申青一號”。

1.2方法

1.2.1生防菌劑、病原菌孢子囊懸浮液制備和植物材料培育。

1.2.1.1生防菌劑的制備。將供試菌株在 LB(LB配方：氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，調(diào)節(jié)pH為7.2)。平板上劃線，28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 14～16 h，待長出單菌落后，挑取單菌落接入含有 5 ml LB 培養(yǎng)液的試管中，置于 28 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)，制成種子液；以1%的接種量將種子液接種于裝有 500 ml LB 培養(yǎng)液的三角瓶中，置于 28 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng) 48 h，待菌液濃度達(dá)到1×109cfu/ml 時稀釋待用。

1.2.1.2黃瓜霜霉病病原菌孢子囊懸浮液制備[5]。傍晚采集發(fā)病嚴(yán)重的新鮮黃瓜霜霉病病葉(采集前 7 d 未施用化學(xué)農(nóng)藥)，用無菌水沖去葉面雜物和原有的孢子囊，用浸水的脫脂棉包住葉柄，置于 18 ℃培養(yǎng)箱中黑暗保濕培養(yǎng) 24 h。用毛筆刷取新長出的孢子囊轉(zhuǎn)入無菌水中，稀釋至1×105孢子囊/ml，在18 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 h，待有大量游動孢子囊出現(xiàn)時使用。

1.2.1.3植物材料培育。將黃瓜種子進(jìn)行表面消毒(70% 無水乙醇表面消毒1～2 min，0.05%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，滅菌水潤洗5次)，播種于育苗盤中，置于 28 ℃、光暗周期為16∶8 h、相對濕度大于70%的溫室中進(jìn)行培育。待黃瓜苗長到2片真葉時進(jìn)行移栽。將黃瓜幼苗移栽裝滿基質(zhì)的盆缽，每缽1株，置于28 ℃、相對濕度大于85%、光暗周期為16∶8 h的溫室中培養(yǎng)。

1.2.2溫室防效和促生試驗。

1.2.2.1生防菌劑防治黃瓜霜霉病的溫室試驗。按照“1.2.1.3”方法培育黃瓜苗，待其長出4片真葉時進(jìn)行灌根和噴霧處理。試驗共設(shè)34個生防菌處理和1個清水對照處理，每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)12株苗。灌根處理菌液濃度為1×108cfu/ml，每株苗用量為25 ml，緩慢澆灌于黃瓜根部。噴霧處理菌液濃度為5×107cfu/ml，按照0.01%的終濃度加入表面活性劑吐溫20，均勻噴霧于黃瓜葉片。噴霧的標(biāo)準(zhǔn)是：每片葉子上有霧狀液滴分布，以不掉落為準(zhǔn)，黃瓜葉片正反面都要噴施。對照處理采用清水處理。生防菌處理5 d后噴霧接種病原菌，接種病原菌20 d后調(diào)查病害嚴(yán)重度并計算生防效果。

病害嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)[5]：0級，無病癥；1級，接種點有輕微病斑，其直徑小于0.5 cm；3級，病斑直徑為0.5～1.3 cm；5級，接種點黃化面積占子葉面積1/2 以下，壞死面積占1/3以下；7級，壞死斑面積占葉面積的1/3～2/3；9級，壞死斑面積占葉面積2/3以上或全株枯死。

病害嚴(yán)重度=∑(各級病株數(shù)×級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100%

防治效果=(對照組病害嚴(yán)重度-處理組病害嚴(yán)重度)/對照組病害嚴(yán)重度×100%

1.2.2.2生防菌劑對黃瓜苗溫室促生試驗。按照“1.2.1.3” 方法培育黃瓜苗，待其長出4片真葉時進(jìn)行灌根和噴霧處理。試驗共設(shè)34個生防菌處理和1個清水對照處理，每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)12株苗。生防菌處理后30 d測量黃瓜株高、葉面積以及測定鮮重、干重和生物量增加等指標(biāo)。

生物量增加=(處理組植株鮮重-對照植株鮮重)/對照植株鮮重×100%

1.2.3大田試驗。

1.2.3.1生防菌劑防治黃瓜霜霉病大田試驗。2013年在江蘇省太倉市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園內(nèi)日光大棚開展大田防效試驗。種植方式為直播，種在大型盆缽中，使用的營養(yǎng)土為進(jìn)口基質(zhì)。試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，設(shè)3個生防菌處理和1個清水對照處理，每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)24株苗，小區(qū)間設(shè)有保護(hù)行。在黃瓜長出5～6片真葉時進(jìn)行第1次處理。噴施生防菌劑為30 ml/株，對照組用等量清水以相同方法噴霧，噴施時均加入終濃度為0.01%的表面活性劑吐溫20。大田試驗采用標(biāo)準(zhǔn)的田間管理模式，并且不再使用其他殺菌劑。生防菌劑間隔 10 d 施藥一次，在黃瓜的整個生長期間共施藥3次；于初次噴霧后7、17和27 d 調(diào)查病害并記錄。大田病害調(diào)查中黃瓜霜霉病分級標(biāo)準(zhǔn)[6]：0級，無病斑；1 級，病斑面積占整個葉面積的 5%以下；3 級，病斑面積占整個葉面積的 6%～10%；5 級，病斑面積占整個葉面積的 11%～25%；7級，病斑面積占整個葉面積的 26%～50%；9 級，病斑面積占整個葉面積的50%以上。噴霧的植株每張葉片均調(diào)查。防效計算方法同“1.2.1.3” 。

1.2.3.2黃瓜葉片葉綠素含量測定。參照曾建敏等[7-8]的方法，具體操作步驟：于生防菌株第1次處理后30 d采集植株頂部葉片，將植物葉片去脈剪碎，稱取0.5 g放入25 ml容量瓶中，每個處理3次重復(fù)。用提取溶劑(用體積比為2∶1的丙酮-無水乙醇混合液配成95%的水溶液)定容，放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗提取24 h，直至組織變白。在663、645 nm波長下以提取溶劑作空白分別測定樣品液的吸光度。

葉綠素濃度(mg/L)按下列公式計算：葉綠素a(Ca)=12.7A663-2.59A645；葉綠素b(Cb)=22.9A645-4.67A663；總?cè)~綠素(Ct)=Ca+Cb。葉綠素含量按下式計算：葉綠素含量(mg/g鮮樣)=C×提取液總體積/樣品重×1 000。

1.3數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)采用 Excel 和 DPS 7.05 版軟件進(jìn)行方差分析，并用LSD法比較各處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌株對黃瓜霜霉病的溫室防效試驗選用已經(jīng)篩選到的對多種病原菌具有拮抗作用的34株生防菌作為黃瓜霜霉病溫室盆栽防效測試菌株。溫室條件下，接種病原菌孢子囊 20 d 后，34株細(xì)菌中有7株對黃瓜霜霉病的防治效果在50%以上(表1)，其中TDGN2的防治效果最好，達(dá)到64.65%，TDGN5的防治效果為61.53%，3BY4的防治效果為60.18%，DS22、TDJN3、TDJN4和TDJN7的防治效果在50%～60%。7個生防菌處理和對照相比，病害嚴(yán)重度均存在顯著性差異。

表1　34株潛在生防菌對黃瓜霜霉病菌的溫室防治效果

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著(LSD法測驗)。

2.2生防菌株對黃瓜的溫室促生作用溫室條件下，生防菌處理30 d后，多個處理的黃瓜苗在株高、葉面積、鮮重和干重等指標(biāo)上與對照之間具有顯著性差異(表2)。其中，有7個菌株對黃瓜苗生物量的增加量超過20%，分別是DS22、2BS5、THGB3、THGB4、TDJN4、TDYN1和TDYN3。

2.3生防菌株對黃瓜霜霉病的大田防效挑選在溫室條件

表2　34株潛在生防菌對黃瓜的溫室促生效果

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著(LSD法測驗)。

下防效和促生效果較好的3個菌株進(jìn)行大田試驗，分別是DS22、TDJN4和THGB4。在生防菌劑初次噴霧后第7、17和27天，所有生防菌處理的病害嚴(yán)重度均低于清水對照(表3)。在生防菌劑初次噴霧后第17和27天，各生防菌處理病害嚴(yán)重度與清水對照相比均存在顯著性差異。在第7天時，TDJN4的防效達(dá)到62.42%；在第17天時，DS22、TDJN1和TDJN4的防效均超過50%；在第27天時，只有TDJN4的防效超過50%。3次統(tǒng)計調(diào)查結(jié)果中，只有TDJN4的防效均超過50%。

表3　3株潛在生防菌對黃瓜霜霉病的大田防治效果

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著(LSD法測驗)。

2.4生防菌株對黃瓜葉片葉綠素含量的影響生防菌株處理黃瓜植株30 d后，測定葉片的葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)生防菌株處理的黃瓜葉綠素總含量均顯著高于清水處理組(圖1)。3個生防菌株DS22、TDJN4和THGB4處理的黃瓜葉片葉綠素總含量分別為2.07、2.15和2.00 mg/g。

3討論

黃瓜作為可四季供應(yīng)的蔬菜，以其豐富的營養(yǎng)價值和美容價值在我國的“菜籃子”工程中占有重要地位。而黃瓜霜霉病作為黃瓜上的主要病害之一，嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。培育抗病品種和使用化學(xué)藥劑是目前防治該病害的主要方法，而對于黃瓜霜霉病生物防治的研究甚少。目前，對霜霉病有良好防效的生物試劑有植物的提取液類[9]、微生物類[10]、植物生長調(diào)節(jié)劑及生物肥類[11-12]、生物蛋白類[13]。該研究通過溫室試驗和大田試驗對黃瓜霜霉病生防菌株進(jìn)行篩選，得到了對黃瓜有較好防病促生效果的菌株TDJN4。

由于黃瓜霜霉病病原菌不能離體培養(yǎng)，無法進(jìn)行生防菌株平板拮抗試驗，因而減少了一個分離篩選生防菌株的快速途徑，所以溫室試驗結(jié)果就顯得特別重要。但溫室試驗人工接種病原菌發(fā)病率較低，所以即使能獲得溫室防效較好的菌株，也很難保證其在日光大棚中的防效。這也是大多數(shù)黃瓜霜霉病生防研究的局限性所在。

該研究尚有許多不理想之處，如進(jìn)行生防菌對黃瓜葉片葉綠素含量影響的試驗中測得的葉綠素含量普遍較低，可能是因為秋冬季大棚有內(nèi)外兩層膜，導(dǎo)致植株無法照射到足夠的陽光，對植株的生長有很大影響。另外，天氣以及人為因素都對該次大田試驗結(jié)果造成了一定影響。在下一步的試驗中，應(yīng)加強(qiáng)大棚管理、規(guī)范田間農(nóng)事操作，爭取得到更加科學(xué)的試驗結(jié)果，為生防菌在大田條件下的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] THOMAS C E.Downy and powdery mildew resistant musk melon breeding line MR-1 [J].Hort Science，1986，21：329.

[2] SHI Y X，LI B J，LIU X M．Progress of study on downy mildew in cucumber(in Chinese)[J]．Northeast Agricultural University，2002，33(4)：465-466．

[3] CAO Q H．Research on cucumber alien translocation line possessing resistance to downy mildew and its application in cucumber breeding(in Chinese)[D]．Nanjing：Nanjing Agriculture University，2006．

[4] SAMOUCHA Y，COHEN Y．Differential sensitivity to mancozeb of mentality sensitive and metalaxy resistant isolates ofPseudoperonosperacubensis[J]．Phytopathology，1984，74：1437-1439．

[5] DU X L．Biological control of grape downy mildew and powdery mildew(in Chinese)[D]．Bao ding：Master Thesis．Agricultural University of He bei，2008．

[6] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.GB /T17980．26-2000農(nóng)藥 田間藥效試驗準(zhǔn)則(一)殺菌劑防治黃瓜霜霉病[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000．

[7] ZENG J M，YAO H，LI T F，et al.Chlorophyll content determination and its relationship with SPAD readings in flue-cured tobacco[J].Molecular Plant Breeding，2009，7(1)：56-62.

[8] YANG M W.Study on rapid determination of chlorophyll content of leaves(in Chinese)[J].Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2002，19(7)：478-481.

[9] ZHAO J，DAI G H，GU Z F，et al.Preventive effect of 20 plant extracts against cucumber downy mildew(in Chinese)[J].Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science)，2005，23(3)：308-311.

[10] 李星，張汀，楊文香，等.芽孢桿菌對黃瓜霜霉病的防治效果研究[J].植物保護(hù)， 2003，29(4)：25-27.

[11] 祝懷發(fā)，邱燁，柴鳳英，等.綠風(fēng)95 植物生長調(diào)節(jié)劑防治溫棚黃瓜霜霉病初報[J].新疆農(nóng)業(yè)科技， 1997(6)：45.

[12] 張清友.微生物肥料抑制黃瓜霜霉病效果初探[J].職業(yè)技術(shù)，2006(12)：178.

[13] 申宏波，文景芝，馬成云，等.Harpins蛋白防治黃瓜霜霉病機(jī)理研究Ⅰ黃瓜接種Harpins蛋白后PAL酶活性的變化[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2005， 21(12)： 330-332.