基于生理生化差異的黃菠蘿雌雄株鑒別技術(shù)研究

張東來(lái)，張 玲 (.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱5008;2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱5008)

自然界中雌雄異株的植物僅占6%，不同性別的植物具有不同的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究雌雄異株植物性別及其鑒定在理論與實(shí)踐中都具有重要意義［1］。例如以種子和果實(shí)為收獲對(duì)象時(shí)需大量的雌株，而獲取以營(yíng)養(yǎng)器官生長(zhǎng)為主的綠化林木有時(shí)雄株具更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

黃菠蘿(Phellodendron amurense Rupr.)是東北三大硬闊樹(shù)種之一，為國(guó)家一級(jí)珍貴樹(shù)種、國(guó)家2級(jí)保護(hù)樹(shù)種和易危物種［2］。黃菠蘿不僅木材具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且還是珍貴的藥用植物。黃菠蘿為雌雄異株植物，性成熟前無(wú)法鑒別其植株性別，一般的樹(shù)木要到5～8年才能性成熟，且雌雄鑒定主要在開(kāi)花期間進(jìn)行，因此黃菠蘿苗木的早期性別鑒定就成了林業(yè)科研及營(yíng)林生產(chǎn)中亟待解決的一個(gè)問(wèn)題［3］。雌雄異株樹(shù)種的性別鑒定方法很多種［4－8］，包括形態(tài)鑒別法、生理指標(biāo)鑒別法、化學(xué)物質(zhì)分析鑒別法、同工酶圖譜鑒別法等。目前已報(bào)道的雌雄鑒定植物種類有紅松、水曲柳、栝樓、中華獼猴桃、沙棘、銀杏等［4－9］。黃菠蘿葉片中富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，該研究采用形態(tài)學(xué)方法、化學(xué)方法(甲基紅法、BTB法、TTC法和斐林試劑法)及生理學(xué)方法(保護(hù)酶活性)等，通過(guò)分析成熟黃菠蘿葉片提取液顏色和光譜吸收值與其性別之間的關(guān)系，探索黃菠蘿幼苗早期性別鑒定技術(shù)，為黃菠蘿人工林恢復(fù)和營(yíng)林生產(chǎn)提供理論參考［9］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 以哈爾濱市香坊區(qū)松樂(lè)公園黃菠蘿成樹(shù)為試驗(yàn)植株，樹(shù)齡平均為40年，郁閉度為0.7左右，林內(nèi)伴生種為白樺、水曲柳、山楊、榆樹(shù)等，灌木為紫丁香、金銀忍冬等。分別在2013年、2014年6月中旬，隨機(jī)取黃菠蘿雌雄株各30株，在每株樣樹(shù)樹(shù)冠上、中、下3個(gè)層次的東、南、西、北4個(gè)方向采摘葉片，將同株樣樹(shù)上所采摘的葉片充分混合裝入袋內(nèi)，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰箱中，冷藏，待測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基紅染色法。按雌雄株分別選取幼葉，洗凈、拭干，稱1 g，加入蒸餾水10 ml，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液，等量加入2 g/L甲基紅溶液，混勻，置于30℃恒溫水浴中保溫，每隔3 h記錄提取液的顏色變化［4］。

1.2.2 溴麝香草酚藍(lán)法(BTB法)。稱取葉片1 g，加入10 ml蒸餾水，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 ml，加入1 g/L的堿性BTB溶液4～5滴，于30℃的恒溫下保溫，觀察其顏色變化，并每隔4 h用分光光度計(jì)測(cè)定其在400～730 nm(每隔30 nm測(cè)吸收值)的吸收值［4］。

1.2.3 氯化三苯基四氮藍(lán)唑法(TTC法)。取葉片0.5 g，剪成小塊，放入試管，加入4 g/L TTC溶液和0.067 mol/L pH=7.0磷酸緩沖液各5 ml，使樣品完全浸入到反應(yīng)液中，置于常溫下浸提2 h，然后加入1 mol硫酸2 ml以終止反應(yīng)，取出葉片，用濾紙吸干水分，在研缽中加入3 ml乙酸乙酯及少量石英砂，研碎提取TTCH，用乙酸乙酯洗研缽并將提取液全部轉(zhuǎn)入10 ml試管中，用乙酸乙酯定容到10 ml，在485～690 nm下測(cè)定吸光值［4］。

1.2.4 斐林試劑法。取葉片1 g，加入10 ml蒸餾水，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液5 ml，分別加入斐林試劑各1 ml，觀察顏色變化及沉淀，在480～690 nm下測(cè)定吸光值［9］。

1.2.5 CAT、POD、SOD 酶活性測(cè)定。酶液提取:稱取 1.0 g新鮮黃菠蘿葉片，液氮研磨，加入6 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液［2］。

1.2.5.1 CAT 酶活性測(cè)定。取 40 μl酶液，加入 2.5 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液和1 ml蒸餾水，不加酶液對(duì)照。在30℃水中水浴10 min，加入0.3 ml 0.1 mol/L 的 H2O2，測(cè)定吸光度。

1.2.5.2 POD 酶活性測(cè)定。取100 μl酶液，加入2.9 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液和1 ml 0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚，不加酶液為對(duì)照。在30℃水中水浴30 min，加入1 ml 8 g/L H2O2，終止反應(yīng)，測(cè)定吸光值。

1.2.5.3 SOD 酶活性測(cè)定。取 100 μl酶液加 3 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液，在正常日光下反應(yīng)20 min，對(duì)照暗處理，測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定。測(cè)定黃菠蘿株高、葉寬、葉長(zhǎng)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，黃菠蘿葉片形態(tài)學(xué)鑒定差異性均不顯著(P＞0.05)，黃菠蘿雌雄株株高、葉寬、葉長(zhǎng)相關(guān)性較小，其相關(guān)系數(shù)分別為 R2=0.111、R2=0.081、R2=0.117。因此，形態(tài)學(xué)方法不能鑒定黃菠蘿雌雄株。

表1 黃菠蘿葉片形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.1.2 甲基紅溶液鑒定。以成熟黃菠蘿幼葉提取液，加入2 g/L濃度甲基紅溶液，30℃水浴3 h后觀察發(fā)現(xiàn)，向葉部提取液中加入甲基紅溶液時(shí)，雄性植株上清液呈現(xiàn)深紅色，雌性植株為橘紅色，雄雌株顏色開(kāi)始變淺，繼續(xù)水浴觀察至24 h，發(fā)現(xiàn)雌雄株提取液顏色明顯變淺，48 h后褪去，并有沉淀物。因此采用甲基紅溶液測(cè)定時(shí)，水浴3 h可作為鑒別雄、雌植株性別的最佳時(shí)期(圖1)。

2.1.3 BTB法。采用溴麝香草酚蘭法(BTB法)對(duì)黃菠蘿雄雌株進(jìn)行鑒定，雄雌株提取液顏色差異明顯，雄性植株深藍(lán)色，雌性植株為棕黃色。在吸收光譜方面，雌雄株的提取液吸光值差異顯著(圖2)。在480 nm下測(cè)定雌雄株提取液吸光值，雄株平均值為 2.680 00 ±0.159 63，雌株平均值為1.389 33±0.076 35。BTB方法鑒定的雌雄株吸光值在480～690 nm處的檢驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，認(rèn)為BTB方法鑒定雌雄株的效果是顯著的。因此，BTB方法可以作為黃菠蘿雌雄株鑒定的方法。

2.1.4 TTC法。用氯化三苯基四氮藍(lán)唑法(TTC法)對(duì)黃菠蘿雌雄植株性別進(jìn)行鑒定，在吸收光譜方面雌雄株的提取液差異顯著。如圖3所示，在480 nm和660 nm下測(cè)定雌雄株提取液吸光值，雄株平均值為 1.643 67±0.176 79和1.841 33±0.098 20，雌株提取液吸光值為 2.067 33 ±0.145 82和2.145 67 ± 0.124 93，顯著水平為 0.009 9(P ＜0.01)，雌雄株之間具有極顯著差異。因此，TTC方法在480、660 nm下可以作為黃菠蘿雌雄株鑒定的方法。

2.1.5 斐林試劑法。雌雄株提取液采用斐林試劑的顯色反應(yīng)具有明顯差異，雌株呈現(xiàn)草綠色，雄株呈現(xiàn)翠綠色。在480～690 nm吸收光譜下，雌雄株的提取液吸光值存在差異，雄株提取液吸光值為1.532 25±0.037 26，雌株提取液吸光值為1.363 75 ±0.059 23，顯著水平為0.038(0.01 ＜P ＜0.05)，認(rèn)為雌雄株之間存在差異，即可認(rèn)為斐林試劑法可以作為鑒定黃菠蘿雌雄株的方法。

2.1.6 保護(hù)酶活性測(cè)定。以6月份40年生成熟黃菠蘿樹(shù)幼嫩葉片提取保護(hù)酶，測(cè)酶活性。從表2中可以看出，黃菠蘿

雌雄株葉片內(nèi)保護(hù)酶活性表現(xiàn)為CAT酶、SOD酶和POD酶活性差異不顯著。因此，測(cè)定葉片保護(hù)酶方法不能作為鑒定雌雄株的方法。

表2 黃菠蘿雌雄株葉片保護(hù)酶活性差異

3 結(jié)論與討論

雌雄株鑒別技術(shù)的應(yīng)用潛力主要在于苗木性別的早期鑒定，該試驗(yàn)所得到的結(jié)果和其他相關(guān)研究所得到的結(jié)果是一致的［9－11］，證明了性別差異與雌雄植株代謝生理有關(guān)。通過(guò)連續(xù)2年的試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，采用甲基紅法、BTB法、TTC法和斐林試劑方法進(jìn)行黃菠蘿性別鑒定，結(jié)果顯示雌雄株具有顯著性差異，表明用這4種方法進(jìn)行黃菠蘿雌雄株鑒定是完全可行的。形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方法表現(xiàn)為差異不顯著，因此，形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方法不能作為鑒定黃菠雌雄株的方法。而化學(xué)藥劑方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果明顯，而且費(fèi)用低廉，可以對(duì)黃菠蘿幼苗期鑒定提供理論支持，在林業(yè)生產(chǎn)中具有很好應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。這些方法的缺點(diǎn)是容易受到溫度、光強(qiáng)及采樣時(shí)間的影響，因此，需要在今后的工作中綜合研究各種因素對(duì)鑒別結(jié)果的影響(例如內(nèi)源激素的差異)，探索更為合適的措施以縮短鑒別過(guò)程所需要的時(shí)間。另外，在染色液的分光光度計(jì)檢測(cè)中的特征吸收峰值可能是提取液中糖類或酚類物質(zhì)與染色劑反應(yīng)后的產(chǎn)物所形成的，這類物質(zhì)還有待進(jìn)一步確定研究。

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