新城疫病毒的分離與鑒定

徐丹雯，魏和朋，胡順林，石火英(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理教研室，禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城病毒引起的雞和多種禽類的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，主要以呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血為特征。不同毒株的致病性也不相同，ND可表現(xiàn)為嚴(yán)重程度有很大的差異的疾病。國際獸醫(yī)局(OIE)將該病定為A類烈性傳染病，我國將其定為一類傳染［1］。人類也可感染新城疫病毒，潛伏期約為48 h，主要引起急性結(jié)膜炎，偶爾也可侵害角膜，病程為7～10 d，一般不經(jīng)治療可自然康復(fù)，不會(huì)在人群中造成傳播［2］。目前NDV采用反轉(zhuǎn)率－聚合酶反應(yīng)(RTPCR)技術(shù)進(jìn)行研究，在其毒力分子基礎(chǔ)方面有了較為深入的了解，也更成熟地將NDV分為強(qiáng)度和弱毒。研究發(fā)現(xiàn)，NDV在復(fù)制過程中融合蛋白(F)的前體F0的形式合成，僅當(dāng)宿主細(xì)胞的蛋白酶介導(dǎo)F0裂解才具有傳染性。F0的第112～117位氨基酸序的裂解位點(diǎn)上，所有NDV的 F蛋白的116位均為精氨酸，所有低毒毒株117裂解位上均為亮氨酸，而113位有另1個(gè)堿性氨基酸。相反，所有強(qiáng)毒株和中毒株117為均為苯丙氨酸，因此強(qiáng)毒和低毒的主要差異是在F0的112～117位的氨基酸基序上。但是，主要與NDV毒力密切相關(guān)的是融合蛋白(F)和血凝素－神經(jīng)氨酸酶(HN)［3］。筆者從江蘇省揚(yáng)州市幾個(gè)活禽交易市場采集雞泄殖腔棉拭子40份，經(jīng)SPF雞胚擴(kuò)增和PCR鑒定，共分離出4株新城疫病毒。對(duì)分離株的F蛋白氨基酸序列研究發(fā)現(xiàn)，分離株裂解位點(diǎn)附近的氨基酸殘基組成均為112ERQERL117，符合弱毒株裂解序列特征，并且分離的NDV之間具有較高的同源性，介于86.3% ～93.9%。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 病料來源。2014年10月從揚(yáng)州市幾個(gè)活禽交易市場采取雞的泄殖腔棉拭子40份。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物。10日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。新城疫LaSota株標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理教研室自制，HI為210;禽流感(H9和H5)單因子陽性血清，由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病理研究室自制，HI均為 211。

1.1.4 1%雞紅細(xì)胞。采集至少3只 SPF公雞或無禽流感或新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.2的0.01 mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1 500 r/min離心10 min，洗滌后用PBS配制成體積分?jǐn)?shù)為1% 紅細(xì)胞懸液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒的分離

1.2.1 病料處理。從揚(yáng)州市幾個(gè)活禽交易市場采集雞泄殖腔棉拭子樣品，共計(jì)40份。樣品反復(fù)凍融3次，4 000 r/min離心5 min，取上清液作為待檢樣品。

1.2.2 雞胚接種。每個(gè)樣品接2枚，每枚經(jīng)尿囊腔途徑接種0.2 ml，置37℃ 孵育5 d，棄去24 h內(nèi)死亡的胚，24 h后死亡的雞胚收取尿囊液，120 h未死亡的雞胚，4℃下過夜，收取其尿囊液。

1.3 血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn) 將無菌收集的雞胚尿囊液以1.0% 雞紅細(xì)胞懸液采用β微量法進(jìn)行HA試驗(yàn)，以HA價(jià)≥3 log2為試驗(yàn)陽性。對(duì)有直接血凝性的樣本進(jìn)行NDV以及H5亞型和H9亞型AIV HI試驗(yàn)。

1.4 NDV F基因部分片段序列測定與分析

1.4.1 提取 RNA 。取尿囊液 350 μl，加入 700 μl的 Trizol液，混勻;室溫放置10 min，然后加入200 μl的氯仿異戊醇，蓋緊漩渦振蕩器搖蕩15 s左右，室溫靜置10 min后，在4℃條件下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min;取上層水相于一新的Ep管，加入550 μl等量異丙醇，室溫放置15 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min;棄去上清液加入700 μl的經(jīng)70%DEPC處理的乙醇，輕輕顛倒數(shù)次混勻，4℃條件下12 000 r/min離心10 min;小心棄去上清液，室溫干燥 5～10 min;加入 10.5 μl DEPC處理的水中，放置10 min后用于cDNA的合成。

1.4.2 cDNA 的合成。取5 μl含 RNA的DEPC水于經(jīng)過DEPC 處理的 200 μl Eppendorf管中;加入反轉(zhuǎn)錄引物 1 μl、2.5 mmol dNTP 2 μl，70 ℃ 溫浴 10 min，快速置冰上 5 min，稍微離心;快速加入 5 × AMV buffers 5 μl、Rnasin 1 μl、RNA反轉(zhuǎn)錄酶 (AMV)1 μl、DEPC 水 10 μl，瞬間離心;繼續(xù) 42 ℃水浴60 min，70℃ 15 min溫浴終止反應(yīng)。

1.4.3 RT-PCR。PCR 體系(25 μl體系):模板(cDNA)2 μl、上游引物 1 μl、下游引物 1 μl、mix Taq 預(yù)混酶 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl。RT-PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。取25 μl反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖電泳中進(jìn)行檢驗(yàn)。設(shè)置DL 20000 DNA Marker;調(diào)節(jié)電壓為80～100 V，電泳40 min左右;小心取出凝膠，放入凝膠成像儀中，觀察照相，保存圖片。若有條帶，切膠測序。

1.4.4 NDV F基因序列分析。參照Liu等［4］的方法選取分離毒株F基因與GenBank中發(fā)表的NDV參考毒株相應(yīng)片段進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與鑒定 從40份病料中成功分離出4株新城疫病毒，分別簡稱為 YZ14、YZ22、YZ29、YZ34，其 HA 效價(jià)分別為25、24、25和23;使用新城疫陽性血清、H9N2亞型禽流感病毒陽性血清和H5亞型禽流感病毒陽性血清，對(duì)分離到的4株有血凝價(jià)的病毒進(jìn)行HI效價(jià)檢測發(fā)現(xiàn)，分離到的病毒與H9和H5亞型的陽性血清反應(yīng)陰性，而與新城疫陽性血清的血凝效價(jià)很高，分別為29、28、210和29(表1)。

表1 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用新城疫病毒的特異性引物對(duì)分離株的基因組RNA進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳觀察，得到特異性擴(kuò)增條帶，YZ14、YZ22、YZ29、YZ34 NDV毒株與預(yù)期設(shè)計(jì)的F基因的擴(kuò)增片段大小相符均約為1 100 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

2.2 NDV F基因序列分析

2.2.1 分離株與參考毒株的同源性比較。將RT-PCR產(chǎn)物送測序，與GenBank中已發(fā)表的參考毒株F基因的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比分析。從圖2可以看出，此試驗(yàn)分離到的NDV毒株的F基因與Genbank已發(fā)表的NDV參考弱毒株的同源性介于73.2% ～77.9%;然而，分離到的NDV之間具有較高的同源性，介于86.3% ～93.9%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，這幾株分離毒株與LaSota株親緣性較近，屬于同一分支(圖3)。

2.2.2 分離株的裂解位點(diǎn)分析。分析F蛋白裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，YZ14、YZ22、YZ29、YZ34 4株病毒F蛋白裂解位點(diǎn)序列為112ERQERL117，具有典型的NDV弱毒株特征。

3 討論

20世紀(jì)90年代以來，新城疫雖然沒有形成世界性的大流行，但是我國雞群新城疫發(fā)病逐年加重，新城疫感染的空間比例不斷擴(kuò)大。自1998年以來，世界范圍以及我國出現(xiàn)機(jī)率最高的流行毒株的基因型為基因Ⅶ型，近年來新發(fā)生鵝源NDV分離株大部分也屬于該型。NDV雖然只有1個(gè)血清型，但病毒的毒力可隨病毒宿主和外界條件的變化而改變。該試驗(yàn)對(duì)活禽市場的表征正常的40只雞采集泄殖腔棉拭子，從40份病料中成功分離到4株新城疫病毒，總陽性率為10%。

新城疫病毒的F基因裂解位點(diǎn)處氨基酸的組成與病毒毒力具有非常密切的關(guān)系。F蛋白是決定新城疫病毒毒力的主要因素。F0裂解位點(diǎn)氨基酸的組成與毒株的毒力有很大的關(guān)系。國內(nèi)外研究表明，NDV強(qiáng)毒株F0蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列一般為112R/K－R－Q－K/R－R－F117，而弱毒株在該位點(diǎn)則以中性氨基酸代替堿性氨基酸，尤其是112位和115位，從而使相應(yīng)序列成為112G/E－K/R－Q－G/E－R－L117，這種F0蛋白不易裂解，以非活性的形式插入子代病毒子中，沒有膜融合活性，感染性很低或無感染性。筆者通過對(duì)分離株的F基因氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，分離株裂解位點(diǎn)附近的氨基酸殘基組成均為112ERQERL117，符合弱毒株裂解序列特征。

大量研究表明，來自水禽的NDV能夠在易感宿主雞或火雞體內(nèi)逐漸演變?yōu)閺?qiáng)毒力 NDV［5－7］。于圣青［8］研究表明無毒性的鵝源NDV在易感宿主雞的體內(nèi)發(fā)生了毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，隨著在氣囊傳代次數(shù)的增加，病毒毒力也隨之增強(qiáng)，并逐漸變成了泛嗜性病毒;F蛋白裂解位點(diǎn)的序列也由開始時(shí)的112ERQERL117變?yōu)?12ERQGRL117(氣囊傳代8次)，再變?yōu)?12ERQKRL117(氣囊傳代9次)，最終變成112ERQKRF117(氣囊傳代9次+腦內(nèi)傳代1次)。雖然，對(duì)活禽市場隨機(jī)采集的家禽泄殖腔棉拭子分離到的4株NDV的裂解位點(diǎn)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，這4株NDV分離株均為弱毒株，但是依然存在一定的潛在威脅，如小型活禽市場一般都沒有將不同種家禽分離開來。相關(guān)研究表明，從發(fā)病鵝群分離的NDV對(duì)雞具有高度的致病性，直接感染或間接接觸感染都可導(dǎo)致雞100%的發(fā)病率和死亡率［9］。同時(shí)，從分離株與參考株的F基因核苷酸序列同源性比較中看出分離到的NDV之間具有較高的同源性，介于86.3% ～93.9%，且這些分離株與疫苗株LaSota的F基因?qū)儆谕环种?，這也很大程度上說明可能是由于我國多年來一直采用以疫苗接種為主、隔離消毒為輔的控制ND流行措施的副作用。

［1］陳溥言.獸醫(yī)傳染?。跰］.5 版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2013:345－351.

［2］金寧一，胡仲明，馮書章，等.新編人獸共患病學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2007:345－358.

［3］韋平，劉祿，韋天超，等.禽Ⅰ型副粘病毒廣西分離株F基因序列及毒力的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25(2):104－106.

［4］LIU H，LWANG Z，WU Y，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of new Newcastle disease virus isolates from the mainland of China［J］.Res Vet Sci，2008，85(3):612 －616.

［5］ALEXANDER D J，MORRIS H T，POLLITT W J.Pollitt，et al.Neweastle disease outbreaks in domestic fowl and turkeys in Great Britain during 1997［J］.Ver Rec，1998，143:209 －212.

［6］HUOVILAINEN A，EK-KOMMONEN C，MANVELL R，et al.Phylogenetic analysis of avian paramyxovirus 1 strains isolated in Finland［J］.Archives of virology，2001，146:1775 －1885.

［7］WESTBURY H.Commentary Newcastle disease virus:An evolving pathogen?［J］.Avian pathology，2000，30(1):5 －11.

［8］于圣青.新城疫病毒某水禽分離株經(jīng)雞體傳代后由非致病型轉(zhuǎn)變?yōu)樗侔l(fā)型的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25(1):59 －64.

［9］WAN H Q，CHEN L G，WU L L，et al.Neweastle disease in geese natural occurrence and experimental infection［J］.Avian pathology，2004，33(2):216－221.