熱激處理對甜柿外植體總酚含量和PAL、PPO、POD活性的影響

楊谷良，范媛媛，鄧先珍,2

（1.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，湖北 武漢 430075）

熱激處理對甜柿外植體總酚含量和PAL、PPO、POD活性的影響

楊谷良1，范媛媛1，鄧先珍1,2

（1.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，湖北 武漢 430075）

甜柿在組織培養(yǎng)過程中極易褐化，為了防止褐變，在培養(yǎng)之前應(yīng)對外植體進行熱激處理。文中研究了熱激處理后的寶華甜柿葉片在培養(yǎng)過程中其酚類物質(zhì)含量和苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性的變化情況，并對熱激處理抑制組培褐變的生理機制進行了初步探討。結(jié)果表明：熱激處理后，寶華甜柿葉片的褐變程度比沒有處理的明顯減輕，其總酚含量與苯丙氨酸解氨酶（PAL）及多酚氧化酶（PPO）活性均有所降低，但熱激處理對其過氧化物酶（POD）活性的抑制效果并不明顯，說明熱激處理通過降低外植體的PAL及PPO活性，抑制酚類物質(zhì)的合成及氧化，減少了褐變產(chǎn)物——醌類物質(zhì)的形成，從而有效抑制了褐變現(xiàn)象的發(fā)生。

寶華甜柿；熱激處理；褐變；酚類物質(zhì)；組織培養(yǎng)

柿Diospyros kakiL.f是柿科Ebenaceae柿屬Diospyros的一種果樹，在我國廣大地區(qū)都有栽培。據(jù)羅正榮等人的研究文獻，我國栽種柿樹的歷史已有2 000多年[1-2]，我國是世界上栽培柿樹最早的國家。寶華甜柿是原產(chǎn)于湖北省羅田縣并于2001年通過良種審定的一個地方品種，寶華甜柿在果實生長發(fā)育過程中不需要經(jīng)過任何人工處理而能自然脫澀，是我國最先審定的一個甜柿品種，而且該品種的果實可以長期貯藏，具有巨大的發(fā)展?jié)摿3]。

近年來，柿樹栽培面積逐漸擴大，社會上對于良種甜柿苗的需求量也急劇增加。由于甜柿具有單性結(jié)實的特性，正常情況下形成的種子數(shù)量比較少，嫁接繁殖時存在與砧木親和力低等不足，所以，采用組織培養(yǎng)措施進行甜柿良種的快速繁殖具有一定的理論意義和重大的生產(chǎn)實際意義。但是，在甜柿組織培養(yǎng)過程中，外植體存在著較嚴重的褐變現(xiàn)象[4-5]，張妙霞等人[4]以甜柿嫩芽為實驗材料進行組織培養(yǎng)時，外植體的褐變率達到90%，嚴重影響了組織培養(yǎng)的繁殖效率。有不少學(xué)者認為，在組織培養(yǎng)時，對培養(yǎng)材料進行適度的熱激處理，能夠降低培養(yǎng)材料內(nèi)總酚的含量，從而能有效減輕褐變的程度[6-7]。然而，查閱文獻資料后發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于熱激處理抑制褐變的研究主要集中在草本植物上，而對于木本植物特別是柿樹的研究報道卻相對較少。為了消除甜柿培養(yǎng)過程中褐變的影響，以羅田地方品種寶華甜柿新生葉片為實驗材料，以MS(1/2N)＋ZT 2.0 mg/L＋TDZ 0.1 mg/L為誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基，通過比較對照組（未經(jīng)熱激處理，其他條件相同）與熱激處理組葉片外植體組培褐變程度，分析熱激處理對酚類物質(zhì)含量和PAL、PPO、POD活性的影響情況，以期揭示熱激處理抑制甜柿組培時外植體褐變的生理機制，從而為通過組織培養(yǎng)進行甜柿工廠化育苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

所選實驗材料來自無菌條件下培養(yǎng)的葉片完全沒有褐變的寶華甜柿幼苗。在取樣之前，先將帶有葉片的枝條于45 ℃下熱激處理30 min，然后選取成熟度基本一致的葉片，將葉片剪成1.0 cm2大小，按每瓶接種3個外植體的標(biāo)準(zhǔn)，將剪好的葉片均勻地接種于MS（1/2 N）＋ZT 2.0 mg /L＋ TDZ 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。對照組的葉片沒有經(jīng)過熱激處理，其他處理方式和培養(yǎng)條件與實驗組完全一致。對照組與實驗組的接種量均為50 瓶，共150個葉片，接種好后全部放入智能光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25.0±0.3）℃，培養(yǎng)過程中，光照強度為（40±5）μmol·m－2s－1，每天光照時間為12 h。分別在培養(yǎng)第0、6、12、18、24天隨機取出4瓶共12個葉片，測定其酚類物質(zhì)含量和PAL、PPO、POD活性，每個指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.2 測定方法

參照有關(guān)文獻報道的方法[8-10]檢測了總酚含量和苯丙氨酸解氨酶( phenylalanine ammonialyase，PAL )、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)及過氧化物酶( peroxidase，POD) 活性等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

檢測中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，處理組和對照組的褐變程度都有所增加，但是經(jīng)過熱激處理后，外植體的褐變程度比對照組明顯降低，總酚含量和PAL、PPO和POD的活性也均低于對照組。熱激處理對甜柿品種組培褐變過程中總酚含量和PAL、PPO和POD活性的影響情況分別如圖1～4所示。

圖 1 熱激處理對甜柿品種組培褐變過程中總酚含量的影響Fig. 1 Effect of hot shock treatment on total phenols content during D. vaki explants browning

圖 2 熱激處理對甜柿品種組培褐變過程中PAL活性的影響Fig. 2 Effect of hot shock treatment on PAL activity during D. vaki explants browning

圖 3 熱激處理對甜柿品種組培褐變過程中PPO活性的影響Fig. 3 Effect of hot shock treatment on PPO activity during D. vaki explants browning

圖 4 熱激處理對甜柿品種組培褐變過程中POD活性的影響Fig. 4 Effect of hot shock treatment on POD activity during D. vaki explants browning

2.1 總酚含量

促使褐變的發(fā)生，氧、酶和底物（酚類物質(zhì)）缺一不可，酚類物質(zhì)含量的高低將影響褐變程度的輕重。由圖1可知，處理組和對照組總酚含量的變化均比較平緩，經(jīng)過熱激處理后，外植體內(nèi)的總酚含量在培養(yǎng)的第6、12、18、24天表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。和對照組相比較，熱激處理后外植體中的總酚含量比對照組分別降低了32.1%、50%、51.6% 和54.7%。

2.2 PAL活性

圖2顯示的是在培養(yǎng)期間經(jīng)熱激處理的寶華葉片外植體中PAL活性的變化情況。由圖2可知，與對照組相比，在培養(yǎng)的第0天到第24天，熱激處理后外植體內(nèi)PAL的活性一直低于對照組；在培養(yǎng)的第1～6天，對照組的PAL活性快速增加，而熱激處理后的外植體并沒有表現(xiàn)出這一特性。

2.3 PPO活性

圖3是處理組和對照組的外植體在培養(yǎng)過程中PPO活性的變化情況。從圖3中可以看出， 熱激處理組外植體的PPO活性的變化趨勢相對比較平緩，在整個實驗期間，熱激處理組外植體的PPO活性一直都比對照組的低，在培養(yǎng)的第0、12、18、24天，處理組外植體的PPO活性比對照組分別低了33.3%、9.5%、53.8% 和33.3%，這表明熱激處理能夠抑制外植體內(nèi)PPO的活性。

2.4 POD活性

不管是熱激處理組還是對照組，POD活性均呈現(xiàn)出逐漸增加的變化趨勢。但是，在整個觀測過程中，處理組的POD活性均比對照組低，而且這種差異呈現(xiàn)出逐漸擴大的趨勢，在培養(yǎng)的第24天處理組外植體的POD 活性比對照組降低了15.26 μmol·mg－1min－1（見圖 4）。

2.5 相關(guān)性分析

對寶華外植體中總酚含量、酚合成的代謝酶類進行了相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。由表1可知，總酚含量與PAL、PPO、POD活性的相關(guān)系數(shù)分別為－0.605 3、0.128 3、－0.596 9，其中，PPO與總酚的合成呈正相關(guān)性，PAL、POD則表現(xiàn)出負相關(guān)性，PPO與總酚合成的相關(guān)性最大。

表 1 總酚含量與PAL、PPO和POD活性的相關(guān)性分析結(jié)果Table 1 Correlation analysis between total phenols content and activities of PAL, PPO and POD

3 結(jié)論與討論

熱激處理是指當(dāng)植物在超過它正常生長溫度10～15 ℃的環(huán)境中處理一定時間后，植物體內(nèi)將會合成熱激蛋白（heat shot protein, hsp），防止自身受到傷害。Kanabus等人[11]研究發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)的馬鈴薯細胞經(jīng)過42 ℃處理一定時間后，細胞內(nèi)的hsp大量合成，而其它蛋白的合成卻受到明顯抑制。但是，在單位時間內(nèi)，由于細胞合成蛋白的總量是有限的，所以，大量熱激蛋白的合成，將會抑制細胞內(nèi)其它蛋白的合成，或者使變性的蛋白發(fā)生降解。熱激誘導(dǎo)后，外植體內(nèi)PAL蛋白的翻譯受到了抑制，或者通過加速PAL的代謝，從而降低了PAL的活性。隨著熱激過程的結(jié)束，對PAL合成的抑制作用逐漸解除，外植體內(nèi)PAL的含量不斷增加，在表型上表現(xiàn)為褐化程度逐漸增加。

PPO和POD都是參與植物防御反應(yīng)的酶。余亮等人[12]研究認為，酚類物質(zhì)經(jīng)酚氧化酶（PPO或POD）氧化形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)再經(jīng)聚合生成褐色物質(zhì)，從而導(dǎo)致褐變的發(fā)生。組織培養(yǎng)過程中，由于外植體受到機械和滲透等方面的影響，PPO和POD的合成水平會有所增加，但是，經(jīng)過熱激處理后，蛋白質(zhì)合成水平受到抑制，故能減輕褐變的發(fā)生。Fukumoto等人[13]在50 ℃條件下對鮮切萵苣進行處理后發(fā)現(xiàn)，處理后的萵苣在貯藏過程中其PPO和POD的活性顯著降低，從而得出PPO和POD的合成在熱激條件下受到了抑制。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，總酚含量與PPO活性呈正相關(guān)，而與POD活性呈負相關(guān)。這可能因為，在培養(yǎng)的甜柿外植體中，主要是由PPO催化酚類物質(zhì)氧化形成醌。張?zhí)m等人[14]在研究蠶豆褐變酶促機理時也發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)的合成與PPO有正相關(guān)性。由此可見，熱激處理抑制了PPO活性的增強，能限制酚類物質(zhì)的催化氧化，這可能是熱激處理減輕寶華甜柿組培褐變程度的主要原因之一。

[1]羅正榮,蔡禮鴻,胡春根.柿屬植物種質(zhì)資源及其利用現(xiàn)狀[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1996,15(4)：381－388.

[2]孫 鵬,傅建敏,周道順,等.柿屬植物種子表型多樣性及其萌發(fā)與幼苗生長研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(11)： 19 － 25.

[3]李先明.寶華甜柿品種特性及栽培技術(shù)要點[J].西南園藝,2004, 32(2)：68 － 70.

[4]張妙霞,孔祥生,郭秀璞.柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,33(1)：87－91.

[5]孫 蕾,王太明,喬勇進,等.果實褐變機理及研究進展[J].經(jīng)濟林研究,2002,20(2)：92－94.

[6]王成韜.海南粗榧愈傷組織增殖及抗褐變研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué) ,2013：12.

[7]Martin-Diana AB, Rico D, Barry-Ryan C, et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed iceberg lettuce and crude extracts[J].Biosce Biotechnol Biochem,2005, 69(9)：1677 － 1685

[8]印 芳,葛 紅,彭克勤,等.蝴蝶蘭組培褐變與酚酸類物質(zhì)及相關(guān)酶活性的關(guān)系[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,41(7)：2197－2203.

[9]陳鴻鵬,譚曉風(fēng).超氧化物歧化酶(SOD)研究綜述[J].經(jīng)濟林研究 ,2007,25(1)：59－ 65.

[10]韓 剛,韓恩賢,李凱榮.油菜素內(nèi)酯對沙棘抗旱生理的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2007,27(3)：5－9.

[11]Kanabus J, Pikaard C S, Cherry J H. Heat shock protein in tobacco cell suspension during growth cycle[J]. Plant Physiol,1984, 75： 639 － 644.

[12]余 亮.蘋果砧木M9和M26快繁體系的建立及移栽生理研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2013：35.

[13]Fukumoto L R, Toivonen P M A, Delaquis P J. Effect of wash water temperature and chlorination on phenolic metabolism and browning of stored Iceberg lettuce in photosynthetic and vascular tissues[J].J Agr Food Chem,2002,540：4503 － 4511.

[14]張 蘭,鄭永華,汪 峰,等.熱激處理對冷藏蠶豆種子褐變和有關(guān)酶活性的影響[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報,2003,29(4)： 327 － 331.

Effects of heat shock treatment on total phenol content and PAL, PPO,POD activities inDiospyros vakiexplants

YANG Gu-liang1, FAN Yuan-yuan1, DENG Xian-zhen1,2
(1.Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, Hubei, China; 2.Hubei Academy of Forestry, Wuhan 430075, Hubei, China)

The explants ofDiospyros vakiis easy to occur browning during tissue culture process. In order to prevent browning, explants should be treated by heat shock before cultivation. Phenols content and activities of PAL, PPO and POD inD. vakic.v. ‘Baohuatianshi’ leaves were researched, and physiological mechanism of heat shock treatment preventing browning was discussed. The results showed that browning degree of leaves was decreased significantly after heat shock treating, and total phenol content and activities of PAL and PPO were also lower than the control. But preventing effect of hot shock treatment on POD activity was not obvious. It suggested that heat shock treatment could inhibit synthesis and oxidation of phenols, and decreased quinones content, which was browning production, through reducing activities of PAL and PPO in explants. So heat shock treatment could effectively prevent browning.

Diospyros vakic.v. ‘Baohuatianshi’; heat shock treatment; browning; phenols; tissue culture

S682.31 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981(2015)01—0115—04

2014-06-27

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2013BAD14B05）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503240）。

楊谷良，副教授，博士。

鄧先珍，研究員。E-mail：1124675534@qq.com

楊谷良,范媛媛,鄧先珍.熱激處理對甜柿外植體總酚含量和PAL、PPO、POD活性的影響[J].經(jīng)濟林研究,2015,33(1)：115－118.

[本文編校：伍敏濤]