苦蕎殼總黃酮超聲輔助醇提工藝的優(yōu)化

楊 芳 楊萬林 陳錦玉 邵金良 蘭珊珊（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650223）

苦蕎麥為蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）雙子葉植物，學(xué)名韃靼蕎麥（F.tataricum）［1］，主要分布在中國的西南山區(qū)［2］。它含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)及黃酮類物質(zhì)等［3］。目前，蕎麥加工中的主要原料是蕎麥仁，而苦蕎殼作為苦蕎加工過程中的主要副產(chǎn)物，并未得到充分利用［4］。研究［5－7］表明，黃酮類化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫力等多種生物活性。而苦蕎殼富含黃酮類化合物且價格低廉，是潛在的黃酮類化合物的提取原料。

傳統(tǒng)的蕎麥黃酮的提取方法主要有：熱水浸提法、堿水浸提法、乙醇回流提取法等，但是這些方法提取率低，提取時間較長［8］。新興的方法主要有微波輔助提取法、亞臨界提取法和超聲波輔助提取法［9］。微波輔助提取法和亞臨界提取法對設(shè)備要求較高，操作工藝條件需嚴(yán)格控制；而超聲輔助提取法利用超聲波在液體中的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用，提高植物中有效成分的溶出速率，具有提取效率高、提取時間短的優(yōu)點，且操作簡單、成本低廉，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。雖已有學(xué)者［10，11］采用超聲波輔助提取法對蕎麥籽粒、蕎麥麩皮和蕎麥殼中的蕎麥黃酮提取工藝進(jìn)行了研究，但因提取原料不同，提取工藝也有較大的差異。本試驗擬以苦蕎殼為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對苦蕎殼總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨為苦蕎殼總黃酮的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

云南苦蕎殼：云南省昆明市尋甸縣。蕎麥殼在105℃下烘干至恒重，粉碎過60目篩，備用；

95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計：UV－1800PC型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：KM－615D型，廣州市科潔盟實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮得率的測定 參照文獻(xiàn)［12］測定樣品中的總黃酮含量，按式（1）計算總黃酮得率。

1.2.2 單因素試驗 本試驗以苦蕎殼中總黃酮得率為指標(biāo)，分別選取乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間和料液比4個因素作5個水平的單因素試驗，每個試驗重復(fù)3次。

（1）乙醇濃度：準(zhǔn)確稱取2.0g苦蕎殼粉末，置于250mL的燒杯中。在超聲溫度60℃、超聲時間30min、料液比1∶40（m∶V）的條件下，分別加入40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液進(jìn)行超聲提取。研究乙醇濃度對苦蕎殼總黃酮得率的影響。

（2）超聲溫度：準(zhǔn)確稱取2.0g苦蕎殼粉末，置于250mL的燒杯中。在乙醇濃度70%、超聲時間30min、料液比1∶40（m∶V）的條件下，設(shè)定不同超聲溫度（40，50，60，70，80℃）進(jìn)行超聲提取。研究超聲溫度對苦蕎殼總黃酮得率的影響。

（3）超聲時間：準(zhǔn)確稱取2.0g苦蕎殼粉末，置于250mL的燒杯中。在乙醇濃度70%、超聲溫度60℃、料液比1∶40（m∶V）的條件下，設(shè)定不同超聲時間（10，20，30，40，50min）進(jìn)行超聲提取。研究超聲時間對苦蕎殼總黃酮得率的影響。

（4）料液比：準(zhǔn)確稱取2.0g苦蕎殼粉末，置于250mL的燒杯中。在超聲溫度60℃、超聲時間30min、乙醇濃度70%的條件下，設(shè)定不同料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，m∶V）進(jìn)行超聲提取。研究料液比對苦蕎殼總黃酮得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken試驗設(shè)計原理，選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間、溫度進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，確定總黃酮最佳提取條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design－Expert 8統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對苦蕎殼總黃酮得率的影響 由圖1可知，乙醇濃度對苦蕎殼總黃酮得率的影響較大。總黃酮得率先隨乙醇濃度的升高而升高，當(dāng)乙醇濃度為70%時達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢。隨著乙醇濃度的逐漸升高，醇溶性物質(zhì)的溶出率也隨之增加，所以總黃酮得率先呈現(xiàn)升高的趨勢；但是隨著乙醇濃度的增加，苦蕎殼中的一些醇溶性和脂溶性的雜質(zhì)溶出量也逐漸增多，這些成分可能會與乙醇—水分子體系結(jié)合，與黃酮類化合物形成競爭，影響苦蕎殼黃酮類物質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降。綜合考慮試驗結(jié)果、成本及后處理因素，乙醇溶液濃度控制在70%左右為宜。

圖1 乙醇濃度對苦蕎殼總黃酮得率的影響Figure 1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2 超聲溫度對苦蕎殼總黃酮得率的影響 由圖2可知，溫度對總黃酮得率影響較大。在提取溫度低于60℃時，隨著提取溫度的上升，總黃酮得率也隨之增加，高于60℃后，總黃酮得率急劇下降。這可能是由于隨著溫度的升高，總黃酮在乙醇溶液中的溶解度增加；同時由于溫度升高，分子運動加快，擴(kuò)散速率增加，促使提取速度加快［13］。但是當(dāng)溫度過高，黃酮類物質(zhì)容易被氧化，分子結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此，提取過程中溫度不宜過高，以60℃左右為宜。

圖2 超聲溫度對苦蕎殼總黃酮得率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3 超聲時間對苦蕎殼總黃酮得率的影響 由圖3可知，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)超聲時間為30min時達(dá)到最大值，隨后總黃酮得率呈下降趨勢。超聲時間的延長可有效增加原料與提取液的接觸時間，提高總黃酮的提取率；超聲時間過長，醇溶性雜質(zhì)的溶出量也會增加，對黃酮形成競爭性抑制，使總黃酮得率下降。因此，超聲時間控制在30min左右為宜。

圖3 超聲時間對苦蕎殼總黃酮得率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4 料液比對苦蕎殼總黃酮得率的影響 由圖4可知，總黃酮得率先隨料液比的增大而增大，當(dāng)料液比為1∶50（m∶V）時達(dá)到最大值，隨后隨著料液比的增加，總黃酮得率呈下降趨勢。增大料液比，可使蕎殼與溶劑的接觸面積增大，有利于有效成分的溶出，提高提取率；但是隨著料液比的增加，溶劑用量增多，達(dá)到提取完全所需時間會相應(yīng)增長，同時浸出的黃酮對未浸出的黃酮有抑制浸提作用，使黃酮類物質(zhì)的溶出速率減慢，從而影響總黃酮得率，且大量的溶劑會對后續(xù)的濃縮等操作帶來不便。因此料液比控制在1∶50（m∶V）左右為宜。

圖4 料液比對苦蕎殼總黃酮得率的影響Figure 4 Effect of material－to－liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及模型建立 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、超聲時間和溫度4個因素中較優(yōu)的水平（表1），采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲輔助醇提法提取蕎麥黃酮的最佳工藝條件，試驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

表2 苦蕎殼總黃酮提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Flavonoids from the analysis of programs and results by response surface

采用Design－Expert 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到蕎麥總黃酮得率（Y）對乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度的二次多項回歸方程：

由表3可知，試驗中選用的模型P＜0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平，具有統(tǒng)計學(xué)意義；相關(guān)系數(shù)R2＝0.989 2，表明該方程的擬合效果較好，可以用于不同條件下苦蕎殼中總黃酮提取工藝的理論預(yù)測；失擬項P＝0.840 3，不顯著，說明該方程對試驗擬合較好。乙醇濃度和超聲溫度對總黃酮得率的影響極顯著，超聲時間和料液比對總黃酮得率的影響不顯著；二次項對總黃酮得率均達(dá)到極顯著水平；交互項CD對總黃酮得率的影響極顯著，AD對總黃酮得率的影響顯著，其余交互項均不顯著。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 圖5直觀地反映了乙醇濃度、料液比、超聲時間、提取溫度4個因素之間的交互作用對總黃酮得率的影響。響應(yīng)面圖中曲線走勢越陡，表明該因素對總黃酮得率的影響越大；走勢平滑，則影響較小。等高線圖中橢圓形表示兩因素交互作用對總黃酮得率影響顯著，圓形則相反。由圖5可知，乙醇濃度和溫度、超聲時間和溫度的響應(yīng)面圖曲線坡度較陡，等高線圖呈橢圓形，說明其交互作用對總黃酮得率影響顯著；料液比和溫度的交互作用對總黃酮得率的影響也較大，但是未達(dá)到顯著水平（P值為0.119 2），這與方差分析結(jié)果相一致。當(dāng)乙醇濃度為64%～74%，料液比為1∶44～1∶57（m∶V），提取時間為24～36min，溫度為55～63℃時，總黃酮得率較高。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established regression model

R2＝0.989 2，Adeq Precision＝35.15＝0.978 3，＝0.958 2，CV＝1.26%；＊表示顯著水平（P＜0.05），＊＊表示極顯著水平（P＜0.01）

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 1.93 14 0.14 91.31 ＜0.000 1 2.11E－02 14 1.51E－03失擬項 1.16E－02 10 1.16E－03 0.48 0.840 3純誤差 9.58E－03 4 2.40E－03總變異＊＊A 0.06 1 0.06 36.46 ＜0.000 1 ＊＊B 4.29E－03 1 4.29E－03 2.84 0.113 9 C 1.69E－04 1 1.69E－04 0.11 0.743 2 D 0.13 1 0.136 86.61 ＜0.000 1 ＊＊AB 6.00E－04 1 6.00E－04 0.40 0.538 6 AC 9.02E－05 1 9.02E－05 0.06 0.810 4 AD 8.74E－03 1 8.74E－03 5.79 0.030 5 ＊BC 2.26E－03 1 2.26E－03 1.49 0.241 8 BD 4.16E－03 1 4.16E－03 2.75 0.119 2 CD 1.55E－02 1 1.55E－02 10.26 0.006 4 ＊＊A2 0.65 1 0.65 427.76 ＜0.000 1 ＊＊B2 0.18 1 0.18 121.01 ＜0.000 1 ＊＊C2 0.25 1 0.25 166.43 ＜0.000 1 ＊＊D2 1.30 1 1.30 862.30 ＜0.000 1 ＊＊殘差1.95 28

圖5 各兩因素交互作用對總黃酮得率影響Figure 5 Effects of pairwise interactions of the factors on the extraction rate of total flavonoids

通過Design－Expert 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，苦蕎殼總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇濃度69.00%，料液比1∶50.71（m∶V），提取時間30.03min，提取溫度58.86℃，總黃酮得率的預(yù)測值為3.568%?？紤]實際操作，將試驗條件修改為乙醇濃度69%，料液比1∶51（m∶V），提取時間30min，提取溫度59℃。

2.3 苦蕎殼總黃酮最佳提取條件驗證實驗

在乙醇濃度69%，料液比1∶51（m∶V），提取時間30min，提取溫度59℃的條件下進(jìn)行超聲波輔助乙醇浸提苦蕎殼總黃酮試驗，平行驗證3次，測得總黃酮的平均得率為3.542%，與預(yù)測值3.568%接近，偏差較小。結(jié)果表明該回歸模型能較好地預(yù)測苦蕎殼總黃酮得率，得到的最佳工藝條件比較可靠。

3 結(jié)論

本試驗以單因素試驗為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化超聲輔助提取苦蕎殼中總黃酮的工藝條件，得到超聲輔助提取苦蕎殼中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度69%，料液比1∶51（m∶V），提取時間30min，提取溫度59℃，在該工藝條件下總黃酮的實際得率為3.542%。通過與王廷璞等［14］報道的采用浸提法提取苦蕎殼中總黃酮的工藝相比，該工藝條件縮短了提取時間，顯著提高了總黃酮得率。本研究得到的最佳工藝條件可為工業(yè)提取蕎麥黃酮提供參考，為充分開發(fā)利用苦蕎殼中黃酮提供依據(jù)。

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