中藥藥渣發(fā)酵生產(chǎn)毛云芝菌漆酶培養(yǎng)基的工藝研究

岳 鹍 潘志恒 孫勇民（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350）

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）是一類含銅多酚氧化酶，真菌漆酶因其來源廣泛、催化活性強(qiáng)而具有廣泛應(yīng)用前景和價(jià)值［1，2］，但真菌漆酶通常為次級(jí)代謝酶，產(chǎn)酶周期長(zhǎng)且產(chǎn)酶量低，嚴(yán)重限制了漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)［3，4］。

中國(guó)是中藥資源消耗大國(guó)，中成藥生產(chǎn)、中藥飲片炮制、含中藥成分輕化工產(chǎn)品生產(chǎn)過程中均有大量藥渣產(chǎn)生。中藥藥渣種類多樣、濕度高、處理難度大，目前大部分均采用焚燒或填埋方式進(jìn)行處理，既造成了中藥資源的浪費(fèi)，又造成了水體、大氣的污染。由于中藥藥渣中含有較豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如多糖、木質(zhì)素、氨基酸及微量元素等，部分研究［5，6］表明一些中藥藥渣可顯著促進(jìn)真菌生長(zhǎng)及次級(jí)代謝酶的產(chǎn)生，目前僅有利用白芍藥藥渣固體發(fā)酵亮菌產(chǎn)漆酶的研究［7］，未見利用藥渣進(jìn)行液體發(fā)酵的相關(guān)研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬以常見中藥藥渣為研究對(duì)象，篩選獲得合適中藥藥渣誘導(dǎo)漆酶產(chǎn)量提高的同時(shí)，發(fā)揮真菌生物降解作用，充分利用中藥渣的生物質(zhì)資源，使其變廢為寶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

毛云芝菌（Coriolus hirsutus）：由安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，4℃下保存于PDA斜面培養(yǎng)基中；

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、溶性淀粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏：生化試劑，天津市化學(xué)試劑一廠；

五水合硫酸銅、硫酸鎂、磷酸二氫鉀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；

2，2’－聯(lián)氮二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸鹽）（ABTS）：分析純，Aladdin Chemistry Co.Ltd。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX－75KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZWYR－2102C型，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：T6系列，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

潔凈工作臺(tái) ：HCB－1800H型，海爾集團(tuán)；

電子天平：ME104E型，梅特勒—托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件

（1）液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯汁30%（m/V），葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然。

（2）搖瓶培養(yǎng)基：小麥麩皮3%（m/V），蛋白胨0.2%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自然。

（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)條件：在250mL三角瓶中，裝液量50mL，接種量10mL，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min，振蕩培養(yǎng)12d［8］。

1.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶酶活的影響 采用搖瓶培養(yǎng)基，在接種量20%，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min的條件下對(duì)毛云芝菌進(jìn)行培養(yǎng)，每24h取50mL發(fā)酵液，分析毛云芝菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況。

1.2.3 中藥藥渣對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，以搖瓶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在搖瓶培養(yǎng)基中分別加入10%（m/V）防風(fēng)、川芎、當(dāng)歸、芍藥、大黃、麻黃、連翹及蒼術(shù)8種中藥渣，比較不同類型中藥藥渣對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.4 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，以搖瓶培養(yǎng)基 為 基 礎(chǔ)，在 蛋 白 胨 0.2% （m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自然的條件下，分別以3%（m/V）的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉及麩皮為碳源，比較不同碳源對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.5 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，以搖瓶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在小麥麩皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然的條件下，分別以0.2%（m/V）的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、花生粉、黃豆粉和尿素為氮源，比較不同氮源對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.6 中藥藥渣添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，以搖瓶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在搖瓶培養(yǎng)基中分別加入6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%（m/V）大黃藥渣，比較不同藥渣添加量對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.7 碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，以搖瓶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在小麥麩皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 自 然 的 條 件 下，分 別 加 入 0.16%，0.18%，0.20%，0.22%，0.24%，0.26%，0.28%（m/V）蛋白胨，考察不同C/N比對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.8 pH值對(duì)毛云芝菌產(chǎn)酶的影響 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，以搖瓶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在蛋白胨0.2%（m/V），小麥麩皮3%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L的條件下，分別在pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0下進(jìn)行培養(yǎng)，比較不同pH值對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.9 理化分析方法

（1）菌絲干重的測(cè)定：采用干燥稱重法［9］。

（2）漆酶活力的測(cè)定：采用分光光度法［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛云芝菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶酶活的影響

由圖1可知，在初始無藥渣添加的搖瓶培養(yǎng)基中，1～3d時(shí)毛云芝菌處于調(diào)整期，此階段毛云芝菌產(chǎn)酶能力較弱；3～9d時(shí)毛云芝菌進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，伴隨著毛云芝菌的快速生長(zhǎng)，其產(chǎn)酶能力也迅速增強(qiáng)；9～12d時(shí)毛云芝菌生長(zhǎng)逐步進(jìn)入穩(wěn)定期，此階段毛云芝菌產(chǎn)酶能力及酶活逐步達(dá)到峰值；培養(yǎng)12d后，毛云芝菌產(chǎn)酶能力隨著菌絲體進(jìn)入衰亡期而逐步降低。因此，根據(jù)培養(yǎng)變化曲線確定菌種培養(yǎng)時(shí)間為12d。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 1 Effects of culture time on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2 毛云芝菌藥渣培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 中藥藥渣對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖2可知，8種中藥藥渣對(duì)毛云芝菌培養(yǎng)影響效果存在明顯差異。毛云芝菌漆酶是一種誘導(dǎo)酶，研究［11］表明，漆酶的合成與菌絲體的生長(zhǎng)沒有明顯的相關(guān)性，在毛云芝菌生產(chǎn)過程中通常需要添加誘導(dǎo)劑促進(jìn)漆酶的分泌。常見的誘導(dǎo)劑有小分子芳香化合物、木質(zhì)素、糖苷類物質(zhì)及酚類物質(zhì)等［12］。試驗(yàn)［13］表明，大黃藥渣中的土大黃甙、麻黃藥渣中的鼠李糖甙及芍藥藥渣中的芍藥甙均能有限促進(jìn)漆酶的分泌；防風(fēng)、連翹及蒼術(shù)藥渣中富含的色酮、內(nèi)酯類物質(zhì)對(duì)漆酶分泌影響不明顯；當(dāng)歸、川芎藥渣對(duì)漆酶的分泌存在明顯的抑制作用，這可能是由于當(dāng)歸、川芎藥渣中富含的藁本內(nèi)酯、川芎釅內(nèi)酯等揮發(fā)性油性成分具有明顯的抑制真菌活性作用造成的。綜合考慮，試驗(yàn)選擇大黃藥渣作為添加中藥藥渣。

圖2 中藥藥渣對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 2 Effects of different medicine slag on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

圖3 碳源對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 3 Effects of different carbon sources on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，毛云芝菌利用天然碳源的能力較強(qiáng)，能夠生長(zhǎng)的基質(zhì)廣泛。從毛云芝菌菌絲體生長(zhǎng)情況上看，可溶性淀粉、葡萄糖及蔗糖等作為碳源時(shí)，雖促進(jìn)了毛云芝菌菌絲體生物量的提高，但產(chǎn)酶酶活卻很低，這表明毛云芝菌產(chǎn)酶與其菌絲體的生長(zhǎng)沒有明顯的正相關(guān)性，選擇合適的誘導(dǎo)劑及其用量是漆酶優(yōu)化工藝中非常重要的步驟。從產(chǎn)酶酶活上比較，麩皮作為碳源的效果明顯優(yōu)于其他碳源，這可能是由于麩皮中富含的木質(zhì)素類似物、維生素（尤其是B族維生素）均是毛云芝菌漆酶分泌的誘導(dǎo)劑，有效促進(jìn)了毛云芝菌產(chǎn)酶能力的提高［14］。綜合考慮，選擇麩皮作為培養(yǎng)基中的碳源。

2.2.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4可知，生長(zhǎng)在不同氮源培養(yǎng)基上的毛云芝菌菌絲體具有一定差異，毛云芝菌對(duì)黃豆粉、蛋白胨及酵母膏的利用能力要優(yōu)于尿素、牛肉膏和花生粉，這可能是因?yàn)榈鞍纂?、黃豆粉中的部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可作為碳源被利用，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)平衡和物質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖4 氮源對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 4 Effects of different nitrogen sources on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

但從產(chǎn)酶酶活上比較，蛋白胨、酵母膏及牛肉膏3種氮源的效果要優(yōu)于其他3種氮源，這主要是由于花生粉、黃豆粉作為慢速氮源，使用時(shí)毛云芝菌前期生長(zhǎng)速度受到了明顯的影響，菌體積累不足，抑制了漆酶的產(chǎn)生。因此，快速氮源——蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源更為合適。

2.2.4 中藥藥渣添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，毛云芝菌生長(zhǎng)受大黃藥渣添加量的影響不顯著；但產(chǎn)酶酶活受到大黃藥渣添加量的影響，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，造成這種現(xiàn)象是大黃藥渣除了含有誘導(dǎo)漆酶分泌的糖苷類物質(zhì)，同時(shí)還含有一定量的抑制真菌活性的有機(jī)酸（酯）類揮發(fā)油性成分，當(dāng)大黃藥渣添加量不斷增大時(shí)，糖苷類物質(zhì)的誘導(dǎo)作用逐步達(dá)到峰值，繼續(xù)增加藥渣添加量，其中揮發(fā)油性成分抑制真菌活性的作用逐漸顯現(xiàn)，漆酶產(chǎn)量又逐漸下降［15］。因此，綜合考慮產(chǎn)酶酶活和藥渣添加量，大黃藥渣的添加量選擇為12%。

圖5 藥渣添加量對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 5 Effects of different amount of medicine slag on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.5 碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，培養(yǎng)基的C/N是毛云芝菌產(chǎn)酶的重要影響因素。漆酶作為一種代謝產(chǎn)物，一般在培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)耗盡時(shí)才開始分泌；當(dāng)C/N較小時(shí)，毛云芝菌生長(zhǎng)過于旺盛，培養(yǎng)基中氮源充足，抑制了漆酶的分泌；當(dāng)C/N較大時(shí)，培養(yǎng)基中氮源不足，毛云芝菌生長(zhǎng)不良，不利于漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)；當(dāng)C/N為20時(shí)，漆酶活力達(dá)到最高值。因此，本試驗(yàn)C/N比選擇為20。

圖6 碳氮比對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 6 Effects of different C/N ratio on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

2.2.6 pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖7可知，當(dāng)?shù)孜锏某跏紁H值為4.5時(shí)，漆酶活力達(dá)到最高；繼續(xù)升高初始pH值，漆酶活力也逐漸降低，這主要是由于當(dāng)pH值小于4.0時(shí)，毛云芝菌生長(zhǎng)困難，產(chǎn)酶能力也相應(yīng)降低；pH值超過5.0也出現(xiàn)降低趨勢(shì)，其原因主要是酸性條件可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，有益于真菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)真菌漆酶的分泌。考慮到底物在略偏酸條件下可以抑制細(xì)菌的污染，因此云芝菌液體發(fā)酵產(chǎn)酶的初始pH值以4.5～5.0為宜。

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的比較試驗(yàn)

將上述試驗(yàn)優(yōu)化所得的結(jié)果進(jìn)行組合，初步得到的毛云芝菌藥渣培養(yǎng)基的組成為：碳源麩皮3%（m/V），氮源蛋白胨0.2%（m/V），大黃藥渣12%（m/V），MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH 5.0。利用此培養(yǎng)基與初始搖瓶培養(yǎng)基，在相同培養(yǎng)條件下同時(shí)培養(yǎng)12d，比較添加藥渣前后毛云芝菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶酶活的差異。

由表1可知，添加了大黃藥渣的培養(yǎng)基與初始搖瓶培養(yǎng)基相比，毛云芝菌的生物生長(zhǎng)量及產(chǎn)酶酶活均有顯著的提高，大黃藥渣對(duì)毛云芝菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶存在明顯的促進(jìn)作用。

圖7 pH值對(duì)毛云芝菌生物量及其產(chǎn)酶酶活的影響Figure 7 Effects of pH on biomass of Coriolus hirsutus and the activity of laccase

表1 優(yōu)化培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的酶活比較Table 1 Comparison of enzyme activity of laccase cultured in original and optimized medium

3 結(jié)論

本試驗(yàn)開展了利用中藥藥渣促進(jìn)毛云芝菌漆酶產(chǎn)酶效果的影響研究，通過比較多種常見中藥藥渣，發(fā)現(xiàn)大黃藥渣促進(jìn)毛云芝菌產(chǎn)酶能力及產(chǎn)酶酶活的提高效果最為明顯。試驗(yàn)結(jié)果表明，毛云芝菌在初步優(yōu)化的大黃藥渣培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶酶活較原培養(yǎng)基產(chǎn)酶酶活提高了1.4倍。

中藥藥渣是中藥提取生產(chǎn)過程中的廢棄物，處置不當(dāng)易造成污染環(huán)境。然而，中藥藥渣尤其是根莖類中藥藥渣中含有大量的木質(zhì)素、纖維素和功能性成分，具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。目前，中藥藥渣用于固體發(fā)酵技術(shù)的研究相對(duì)較多，本試驗(yàn)結(jié)果表明中藥藥渣用于液態(tài)發(fā)酵也同樣能取得較好的效果，為中藥藥渣的綜合應(yīng)用探索了新途徑。

本試驗(yàn)?zāi)壳爸怀醪綄?duì)各種常見中藥藥渣進(jìn)行了篩選，并針對(duì)大黃藥渣培養(yǎng)基進(jìn)行了初步優(yōu)化，后續(xù)還將對(duì)微量元素、維生素對(duì)毛云芝漆酶藥渣培養(yǎng)條件的影響進(jìn)行深入的研究，以期獲得更高的產(chǎn)酶酶活。

1 司靜，李偉，崔寶凱，等.真菌漆酶性質(zhì)、分子生物學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2011（2）：48～55.

2 劉忠川，王剛剛.真菌漆酶結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展［J］.生物物理學(xué)報(bào)，2013，29（9）：629～645.

3 王鋒，劉英，汪印，等.漆酶及其應(yīng)用［J］.生物加工過程，2012，10（4）：70～76.

4 趙玉萍，陳曉旺.產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基條件的優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2012，28（6）：226～230.

5 Liu Zhi－yu，Zhang Dong－xu，Hua Zhao－zhe，et al.Improvement of laccase production and its properties by low－energy ion implantation［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2010，33（5）：639～646.

6 劉海新，馬浩，黃海娟，等.中藥藥渣的綜合利用研究進(jìn)展［J］.發(fā)酵科技通訊，2014，43（1）：30～32.

7 楊麗紅，葉選怡，凌慶枝，等.中藥渣固體發(fā)酵亮菌產(chǎn)漆酶研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：2 396～2 398.

8 朱友雙.雜色云芝液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶及離子液體對(duì)生物質(zhì)預(yù)處理的研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.

9 李慧蓉.白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：78～83.

10 林俊芳，劉志明，陳曉陽，等.真菌漆酶的酶活測(cè)定方法評(píng)價(jià)［J］.生物加工過程，2009，7（4）：1～8.

11 朱雄偉，胡道偉，梅運(yùn)軍，等.通過碳源與氮源研究白腐菌產(chǎn)漆酶和菌絲體生長(zhǎng)的相關(guān)性［J］.微生物學(xué)雜志，2003，23（3）：12～14.

12 劉家揚(yáng)，蔡宇杰，廖祥儒，等.漆酶高產(chǎn)菌的篩選及產(chǎn)酶優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2010，26（4）：10～14.

13 劉華鋼，申慶榮，劉麗敏.中藥抗菌研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（2）：215～217.

14 趙亮亮.紅芝發(fā)酵產(chǎn)漆酶及其在染料脫色中的應(yīng)用研究［D］.桂林：廣西師范大學(xué)，2010.

15 費(fèi)娜，楊俊杰.大黃等四種中草藥體外抑菌活性比較［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33（1）：18～19.