桑樹細(xì)菌性枯萎病菌對殼聚糖的敏感性研究

王 芳，謝關(guān)林

(1.新縣茶產(chǎn)業(yè)辦公室，河南 信陽 465500；2.浙江大學(xué) 植物保護(hù)系 農(nóng)業(yè)部病蟲分子生物學(xué)開放重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

引言

2006年上半年在浙江杭州地區(qū)發(fā)現(xiàn)一嚴(yán)重的桑樹細(xì)菌性“枯萎”病害，幼齡桑樹發(fā)病初期由枝條上部葉片開始呈失水狀，繼而全株葉片凋萎、枯焦，直至脫落；剝開主干皮層，可見木質(zhì)部褐色條狀斑；病株根部外觀正常，但木質(zhì)部嚴(yán)重變褐。桑農(nóng)在夏伐整枝后出現(xiàn)大批枯死現(xiàn)象。從桑園的發(fā)病情況與病株癥狀看，與桑青枯菌(Ralstonia solanacearum)較為相似。但最大的不同之處是該病一般始于桑樹下部葉片，幼桑上尤為明顯，病葉“枯萎”后由下而上脫落，造成光桿。謝關(guān)林實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過一系列方法，確認(rèn)?！翱菸辈槟c桿菌屬中新種所引起，2011年將該病原新種命名為Enterobacter mori，并已得到國際認(rèn)可。

桑樹細(xì)菌性萎蔫病菌鑒定和檢測方法在謝關(guān)林實(shí)驗(yàn)室已有一定研究，但有關(guān)桑樹細(xì)菌性萎蔫病防控藥劑方面的研究處于剛剛起步階段。本實(shí)驗(yàn)室Li等發(fā)現(xiàn)殼聚糖對假單胞菌（Pseudomonas）等植物病原細(xì)菌具有很好的抑制作用，但對E.mori的抑制作用及對桑青枯菌和桑疫病菌的抑菌效果有待研究。本文研究了不同濃度殼聚糖對Pseudomonas、E.mori及Ralstonia solanacearum的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株見表1，其中R 字頭菌株編號(hào)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；LMG 字頭菌株編號(hào)由比利時(shí)國家菌種保藏中心提供；M 字頭菌株編號(hào)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

表1 試驗(yàn)用菌株

1.1.2 培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基/L：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5 g、瓊脂17 g、蔗糖15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；LB 液體培養(yǎng)基/L：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，溶于800 mL 去離子水中，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.5，加去離子水至總體積為1 L，高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 供試試劑 無水乙醇、TTC、酸溶性殼聚糖A（蟹殼中提取出，從Sigma–Aldrich（St.Louis，MO，USA）獲取，殼聚糖溶解于1%的醋酸中，由NaOH 調(diào)節(jié)pH 至5.6，濃度為10 mg/mL）、磷酸緩沖液（pH 7.0）、乙醇、鋨酸（1%）、丙酮。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖對桑樹細(xì)菌性萎蔫病菌的抑制性研究

（1）選取NA 平板上過夜培養(yǎng)的E.moriR18-2，R.solanacearumM2，P.syringaepv.moriLMG5074 菌株的單菌落接種于10 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，180 r/min，30℃培養(yǎng)12 h；

（2）吸取250μL 菌懸液加入到新的10 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，180 r/min，30℃培養(yǎng)3 h；

（3）在菌懸液中分別加入0、50、100、200μL 10 mg/mL 的Chitoson A 母液，形成ChitosonA 終濃度為0（對照CK）、0.1、0.2、0.4 mg/mL 的菌懸液，180 r/min，30℃培養(yǎng)3h；

（4）吸取10μL 點(diǎn)樣于NA 平板上，每個(gè)濃度點(diǎn)6 個(gè)樣，置于30℃培養(yǎng)48 h；

（5）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

1.2.2 電鏡下觀察R18-2、M2、LMG5074三種桑病原細(xì)菌經(jīng)殼聚糖處理后的細(xì)胞變化情況

（1）選取NA 平板上過夜培養(yǎng)的R18-2、M2、LMG 5074 菌株的單菌落接種于裝有10 mL 液體LB的三角瓶中，180 r/min，30℃培養(yǎng)12 h；

（2）在三角瓶中加入200μL的濃度為10 mg/mL 的Chitoson A 母液，形成ChitosonA終濃度為0.4 mg/mL 的菌懸液，180 r/min，30℃培養(yǎng)6 h；

（3）混勻并吸取1 mL 的菌液離心，收集菌液，加入一定量的2，5-戊二醛固定液固定過夜；

（4）漂洗，倒掉固定液，用0.1 M、pH7.0 的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15 min；

（5）鋨酸固定，用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h；

（6）再漂洗，取出固定液，用0.1 M、pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15 min；

（7）乙醇梯度脫水，用梯度濃度（包括50%、70%、80%、90%和95%五種濃度）的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%的乙醇處理20 min，最后用純丙酮處理20 min；

（8）包埋劑梯度滲透，用V/V=1/1 的包埋劑與丙酮的混合液處理樣品1 h，再用V/V=3/1 的包埋劑與丙酮的混合液處理樣品3 h，最后用純的包埋劑滲透樣品過夜：這一步要將樣品轉(zhuǎn)移到干燥的新的管中，該新管中放入純的包埋劑；

（9）將經(jīng)過滲透處理的樣品分裝到0.5 mL 的eppendorf 管中包埋起來，70℃加熱過夜；

（10）樣品的切割及透射電鏡觀察（TEM，KYKY-1000B，Japan）。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對桑樹細(xì)菌性萎蔫病的抑制作用研究

由圖1 看出，殼聚糖A 對?？菸鶵18-2 抑制作用明顯，且經(jīng)不同濃度的殼聚糖A 處理后的菌落數(shù)目差異顯著。加入0.1 mg/mL 的殼聚糖A 后，R18-2的數(shù)量明顯減少，加入0.2 mg/mL 的殼聚糖A 后，R18-2 數(shù)目繼續(xù)減少，但是加入0.4 mg/mL 的殼聚糖A 后，菌落數(shù)目同殼聚糖A 濃度為0.2 mg/mL 時(shí)接近。表明殼聚糖A 對R18-2 具有抑制作用且最佳抑制濃度為0.2 mg/mL。

圖1 不同濃度殼聚糖A溶液對桑細(xì)菌性枯萎病菌R18-2的抑制作用

由圖2 看出，CK 的菌落數(shù)最多，加入0.1 mg/mL的殼聚糖A 后，菌落數(shù)量減少，并隨著殼聚糖A 濃度的增高，菌落數(shù)目呈減少趨勢。因此，殼聚糖A 對青枯菌M2 具有抑制作用，且隨著殼聚糖A 濃度的增高，抑制作用越明顯。

圖2 不同濃度殼聚糖A溶液對桑青枯病菌M2的抑制作用

由圖3 看出，CK 的菌落數(shù)最多，加入0.1 mg/mL的殼聚糖A 后，桑疫病菌LMG5074 的菌落數(shù)量減少，加入0.2 mg/mL 的殼聚糖A 后，LMG5074 菌落數(shù)量較0.1 mg/mL 時(shí)少，但是加入0.4 mg/mL 的殼聚糖A 后，菌落數(shù)量上升。從圖上看，0.2 mg/mL 的殼聚糖A 對LMG5074 抑制作用最佳，但0.4 mg/mL 的殼聚糖A 對桑疫病菌LMG5074 抑制作用很小。

圖3 不同濃度殼聚糖A溶液對桑疫病菌LMG5074的抑制作用

殼聚糖A 對萎蔫病菌和青枯菌具有顯著的抑制作用，且對萎蔫病菌的作用效果優(yōu)于青枯菌，但殼聚糖A 對桑疫病菌抑制作用不夠明顯。

2.2 電鏡觀察結(jié)果

如圖4、5、6 箭頭所指，三種病原細(xì)菌在殼聚糖A 處理后不同程度地出現(xiàn)質(zhì)膜收縮變形，細(xì)胞內(nèi)泡狀結(jié)構(gòu)及細(xì)胞質(zhì)凝聚的現(xiàn)象。

Helander I M 等研究了殼聚糖對幾種革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜阻隔性能的影響，認(rèn)為殼聚糖與細(xì)胞外膜結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞外膜阻隔性能降低，是殼聚糖具有抑菌能力的主要原因。楊聲等認(rèn)為殼聚糖具有抑制大腸桿菌生長的作用，其作用機(jī)理主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是殼聚糖通過吸附在細(xì)胞表面，形成一層高分子膜，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，從而起到抑菌殺菌作用；另外一種機(jī)理是殼聚糖通過滲透進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，吸附細(xì)胞體內(nèi)帶有陰離子的細(xì)胞質(zhì)，并發(fā)生絮凝作用，擾亂細(xì)胞正的生理活動(dòng)，從而抑制細(xì)菌生長或者殺滅細(xì)菌。

對三種病原菌經(jīng)殼聚糖A 處理后的電鏡觀察證實(shí)了本試驗(yàn)殼聚糖在離體條件下對三種病原菌的抑制效果。殼聚糖對病原細(xì)菌的作用體現(xiàn)在使細(xì)菌細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)膜收縮變形，細(xì)胞質(zhì)凝聚等抑制細(xì)菌生長的現(xiàn)象，從而達(dá)到殺菌作用，殼聚糖對三種桑病原細(xì)菌的作用符合這種作用機(jī)制。

圖4 R18-2細(xì)胞經(jīng)殼聚糖A處理后出現(xiàn)質(zhì)膜收縮變形、胞質(zhì)凝聚現(xiàn)象（個(gè)體）

圖5 M2細(xì)胞經(jīng)殼聚糖A處理后出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)凝聚現(xiàn)象

圖6 LMG5074細(xì)胞經(jīng)殼聚糖A處理后出現(xiàn)質(zhì)膜變形，胞質(zhì)凝聚現(xiàn)象（全體）

3 討論

目前有較多細(xì)菌防治方面的研究，如農(nóng)業(yè)防治、生物防治等。吳小勇等認(rèn)為殼聚糖能損傷微生物細(xì)胞壁、改變細(xì)胞透性、改變蛋白質(zhì)和核酸分子等反面從而達(dá)到抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖對一些植物病原細(xì)菌具有很好的抑制作用，本研究也再次證實(shí)了這一點(diǎn)，殼聚糖對桑樹細(xì)菌性萎蔫病和青枯病有效，但因不同菌株和不同濃度防治效果有所差異。

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