腐植酸生防生物有機(jī)肥對辣椒根腐病防治效果的研究

高 亮

(濰坊島本微生物技術(shù)研究所 濰坊 261041)

辣椒根腐病(fusarium root rot)是保護(hù)地和露地栽培辣椒常見病害之一，各菜區(qū)均有發(fā)生，且一年四季都可發(fā)病，多雨季節(jié)和年份發(fā)病更為嚴(yán)重，常造成根系腐爛、植株枯死。該病主要是由半知菌亞門真菌蝕脈鐮孢(Fusarium vasinfectum)、木賊鐮孢(F. eguiseti)、串珠鐮孢(F. moniliforme)、尖鐮孢(F. oxysporum)侵染所致[1，2]，以蝕脈鐮孢侵染為主。該病菌在土壤中可以存活10年，傳播渠道主要有肥料、工具及流水傳播[3]。不科學(xué)的施肥與管理會(huì)導(dǎo)致土傳病害加劇[4]。目前，對于這種在辣椒連作、重茬栽培中難治的土傳病害，尚沒有找到一種特效的化學(xué)防治方法，而利用農(nóng)業(yè)綜合防治技術(shù)，尤其是生物防治越來越受到重視。辣椒根腐病的致病機(jī)理及防治技術(shù)研究表明，采用生防菌同腐植酸生物有機(jī)肥相結(jié)合為辣椒根腐病的防治開辟了一條新的途徑。

腐植酸肥料及其衍生產(chǎn)品多種多樣，經(jīng)過近40年實(shí)踐，腐植酸肥料以及衍生產(chǎn)品其體系最符合具生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展需要[5]。以腐植酸為發(fā)酵基質(zhì)，通過酵素菌的好氣性高溫發(fā)酵處理，在復(fù)合微生物的侵?jǐn)_和菌絲作用下，以及復(fù)合酶的催化下，腐植酸被部分降解，可溶性小分子腐植酸含量顯著增加，腐植酸的功能顯現(xiàn)出來，表現(xiàn)出腐植酸和生物有機(jī)肥的累加效應(yīng)。在該腐植酸生物有機(jī)肥基礎(chǔ)上，增加生防菌劑可以培育出腐植酸生防生物有機(jī)肥。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是應(yīng)用廣泛的生防菌，其抑制植物病原的范圍很廣，包括根、枝干、葉、花、果部病害，是一種理想的生防微生物[6]。放線菌尤其是鏈霉菌也是應(yīng)用廣泛的生防菌，對辣椒青枯病具有良好的防治效果[7]。木霉菌(Trchodermasp.)是一種對多種植物病原菌都有較強(qiáng)拮抗作用的生防菌[8]，具有生長繁殖速度快，能迅速占據(jù)應(yīng)用空間，可產(chǎn)生抗菌素等作用[9]。

盡管國內(nèi)外關(guān)于辣椒根腐病生物防治研究報(bào)道較多[10，11]，但該技術(shù)尚屬起步階段，在生產(chǎn)上的應(yīng)用效果還不穩(wěn)定。本研究將3種生防微生物菌劑和腐植酸生物有機(jī)肥相結(jié)合，制成4種腐植酸生防生物有機(jī)肥，應(yīng)用到接種辣椒根腐病的土壤中，研究其對辣椒根腐病防治效果，旨在為腐植酸生物菌肥的應(yīng)用和對辣椒根腐病的生物防治研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒品種為荷蘭斯丁格辣椒，適合早春、秋冬季大棚、日光溫室栽培。

供試腐植酸生物有機(jī)肥系山東省濰坊加濰生物科技有限公司利用酵素菌(BYM-FOOD)發(fā)酵褐煤及黑腐酸研制而成，其有效活菌總數(shù)5×107cfu/g、有機(jī)質(zhì)55%、pH7.3。

所用生防菌株系濰坊島本微生物技術(shù)研究所篩選的高效廣譜拮抗性細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌，其中細(xì)菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，放線菌為涇陽鏈霉菌(Streptomyces jingyangensis)，絲狀真菌為康寧木霉(Trichoderma koningii)。

辣椒根腐病病原菌取自山東省臨朐縣冶源鎮(zhèn)福山村多年重茬種植辣椒的圓拱塑料大棚內(nèi)病死辣椒植株鮮品，攜帶根際土壤。在山東省濰坊島本微生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分離純化后，經(jīng)鑒定為蝕脈鐮孢(Fusarium vasinfectum)。

供試土壤為山東省濰坊市奎文區(qū)二十里堡菜田，理化性狀見表1。土壤消毒后，接種辣椒根腐病病原菌孢子懸浮液，保證土壤中孢子濃度維持在1×104cfu/g的濃度水平。

表1 供試土壤的理化性狀Tab.1 The physical and chemical properties of tested soil

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腐植酸生防生物有機(jī)肥的研制

在利用酵素菌進(jìn)行高溫固態(tài)發(fā)酵褐煤和黑腐酸的基礎(chǔ)上，加入生防菌劑，添加比例為1%?；旌仙谰鷦┫悼莶菅挎邨U菌、涇陽鏈霉菌、康寧木霉按1∶1∶1比例混合，單株枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)≥2×109cfu/g，單株涇陽鏈霉菌有效活菌數(shù)≥1×109cfu/g，單株康寧木霉≥1×108cfu/g。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2014年3月20日至8月10日在山東省濰坊市奎文區(qū)二十里堡圓拱大棚內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理：處理1，腐植酸生物有機(jī)肥+混合生防菌劑；處理2，腐植酸生物有機(jī)肥+枯草芽孢桿菌；處理3，腐植酸生物有機(jī)肥+涇陽鏈霉菌；處理4，腐植酸生物有機(jī)肥+康寧木霉；處理5，腐植酸生物有機(jī)肥(不加生防菌劑)；處理6，普通生物有機(jī)肥(系作物秸稈、畜禽糞便生物發(fā)酵產(chǎn)品，其有效活菌數(shù)1×107cfu/g、有機(jī)質(zhì)45%)；處理7(CK)，空白對照，不加腐植酸生物有機(jī)肥或普通生物有機(jī)肥，也不添加生防菌劑，以等量消毒土壤替代。試驗(yàn)所用的所有生物有機(jī)肥均按照土壤質(zhì)量的0.2%使用，折合每667m2用量300 kg。將腐植酸生防生物有機(jī)肥施入土壤中，與土壤充分混合均勻，24

h后定植辣椒。小區(qū)面積20m2，重復(fù)3次。每小區(qū)栽植60株，選取植株大小相當(dāng)?shù)睦苯访?，每穴栽?株，每平方米栽植3株，植株苗齡35天，5葉1心，株高14cm左右，莖粗3

mm左右。試驗(yàn)期間各種管理措施保持一致。病原菌接種后第20天(4月10日)開始觀察記錄發(fā)病情況，之后每隔20天記錄1次，到8月9日，共記錄7次。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取3株活株，按20

cm×20cm×20

cm挖取土壤將辣椒植株取出來，去除掉根系上的土壤后，用無菌水沖洗根系，洗脫在無菌水中的土壤可視為根際土壤。所取土壤充分混勻，用四分法縮分至500g，可視為非根際土壤。根際土壤和非根際土壤用于測定土壤微生物數(shù)量和病原菌數(shù)量。非根際土壤用于測定土壤微生物的生物量。

1.2.3 測定方法

土壤指標(biāo)分析采用常規(guī)土壤農(nóng)化分析方法[12]；土壤微生物采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基。病原菌采用劉麗云等提出的方法測定；土壤微生物生物量碳(SMBC)采用氯仿熏蒸—K2SO4提取-TOC儀測定法[13～16]；土壤微生物生物量氮(SMBN)采用氯仿熏蒸—K2SO4提取-茚三酮比色法[17]；土壤微生物生物量磷(SMBP)采用氯仿熏蒸—NaHCO3提取-過硫酸鉀氧化法[18]。

辣椒病情分級參照姜飛等[19，20]的方法，將病情分成5級：0級為植株沒有病害癥狀；1級為植株基部葉片出現(xiàn)輕微枯黃癥狀，根系出現(xiàn)輕微褐變；2級為植株中下部出現(xiàn)枯黃癥狀，根系出現(xiàn)褐變，但頂芽良好；3級為全株出現(xiàn)枯黃癥狀，根系褐變腐爛；4級為植株枯萎死亡，根系嚴(yán)重褐變腐爛。

病株率(%)=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病數(shù)×該級代表數(shù))/(總數(shù)×最高級代表值)×100

防治效果(%)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

均采用Microsoft Excel 2000進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)軟件DPS6.5 Duncan法進(jìn)行方差分析和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸生防生物有機(jī)肥對辣椒根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響

在整個(gè)試驗(yàn)期間，各處理的辣椒病情指數(shù)均低于CK(圖1)。在病原菌接種后第20天(4月10日)調(diào)查，處理1、處理2、處理3、處理4的病株率均為0，病情指數(shù)均為0；處理5、處理6和CK的病株率分別為1.67%、3.33%、6.67%，病情指數(shù)分別為0.3，0.8，1.7。最后一次調(diào)查(8月7日)，處理1的病情指數(shù)為15.2，比CK(39.2)低61.22%，比處理5(22.6)低32.74%，比處理6(33.4)低54.49%；處理2(18.5)分別比CK、處理5和處理6低52.80%、18.14%和44.61%；處理3(15.4)分別比C K、處理5和處理6低60.71%、31.86%和53.89%；處理4(18.7)分別比C K、處理5和處理6低52.30%、17.26%和44.01%。從防治效果(圖2)可以看出，5月20日調(diào)查，處理1達(dá)到93.20%，處理2、處理3、處理4均達(dá)到86.40%。7月20日調(diào)查，處理1達(dá)到60.4%，處理2、處理3和處理4分別達(dá)到54.40%、62.00%和54.70%，均明顯高于處理6和CK?？梢?，由枯草芽孢桿菌、涇陽鏈霉菌、康寧木霉3種生防菌復(fù)配成的復(fù)合生防菌與腐植酸生物有機(jī)肥相結(jié)合的腐植酸生防生物有機(jī)肥應(yīng)用效果最好，明顯優(yōu)于普通生物有機(jī)肥和由單一生防菌制備成的腐植酸生防生物有機(jī)肥。

圖2 不同處理對辣椒根腐病的防治效果Fig.2 Effect of different treatments on control ef fi ciency of pepper fusarium root rot

2.2 腐植酸生防生物有機(jī)肥對土壤微生物數(shù)量的影響

施用腐植酸生防生物有機(jī)肥對辣椒根際土壤和非根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)有著顯著影響。從表2看出，根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量和辣椒根腐病原菌蝕脈鐮孢的數(shù)量有所減少。與CK相比較，處理1、處理2、處理3和處理4的細(xì)菌數(shù)量分別增加了5.77倍、4.40倍、4.16倍和3.31倍；放線菌數(shù)量分別增加了3.23倍、3.11倍、5.89倍和2.98倍；真菌數(shù)量減少了18.51%、25.63%、41.58%和9.24%；辣椒根腐病菌數(shù)量減少了6.92倍、2.18倍、3.54倍和6.42倍。處理5和處理6同CK相比較，根際土壤中細(xì)菌數(shù)量分別增加3.02倍和2.50倍；放線菌數(shù)量分別增加5.71倍和1.48倍；真菌數(shù)量，處理5比CK有所減少，而處理6與CK相當(dāng)；辣椒根腐病原菌，處理5比CK減少46.19%，處理6比CK減少14.71%。非根際土壤中細(xì)菌、放線菌和辣椒根腐病原菌的變化同根際土壤相似，但真菌則明顯不同于根際土壤，處理間差異顯著。與CK相比較，處理1、處理2、處理3和處理4的細(xì)菌數(shù)量分別增加了6.56倍、7.49倍、6.06倍和6.53倍；放線菌數(shù)量分別增加了6.71倍、6.95倍、11.62倍和7.35倍；真菌數(shù)量分別減少了56.38%、52.43%、53.18%和1.79%；辣椒根腐病菌數(shù)量分別減少了7.46倍、2.51倍、4.43倍和4.65倍。處理5和處理6同CK比較，根際土壤中細(xì)菌數(shù)量分別增加4.79倍和3.93倍；放線菌數(shù)量分別增加10.04倍和5.27倍；真菌數(shù)量分別減少了10.32%和4.65%；辣椒根腐病原菌，處理5比CK減少56.17%，處理6比CK減少4.24%。綜上，施用腐植酸生防生物有機(jī)肥對根際土壤和非根際土壤的細(xì)菌、放線菌數(shù)量均有顯著增加，對真菌有不同程度的減少，對辣椒根腐病菌減少影響較大。此外，腐植酸生物有機(jī)肥比傳統(tǒng)生物有機(jī)肥對根際土壤和非根際土壤中微生物數(shù)量的影響更加明顯。

表2 不同處理對辣椒根際土壤和栽培土壤微生物數(shù)量的影響Tab.2 Effect of different treatments on microbial quantity of capsicum rhizosphere and cultivational soil

2.3 腐植酸生防生物有機(jī)肥對土壤微生物生物量的影響

在土壤肥力評價(jià)指標(biāo)中，生物學(xué)指標(biāo)被日益重視。其中，土壤微生物生物量碳(soil microbial biomass carbon，簡稱SMBC)作為生物指標(biāo)已被國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛地研究[21]，它不僅是土壤碳素循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)也是土壤碳素循環(huán)的驅(qū)動(dòng)力，是反映土壤微生物量大小的最重要指標(biāo)。土壤微生物生物量氮(soil microbial biomass nitrogen，簡稱SMBN)是重要的土壤活性氮庫和源，直接調(diào)節(jié)土壤氮素供給[22]。土壤微生物生物量磷(soil microbial biomass phosphorus，簡稱(SMBP)是重要的土壤活性磷庫和源，直接調(diào)節(jié)土壤磷素供給。無論根際土壤還是非根際土壤，不同處理之間的微生物生物量碳含量均存在顯著差異。從表3可以看出，各處理的根際土壤的微生物生物量碳含量為：處理1＞處理4＞處理1＞處理2＞處理3＞處理5＞處理6＞處理7(CK)，其中處理1最高，達(dá)到1146.52 mg/kg，是CK的1.56倍；處理6最低，達(dá)到864.34 mg/kg，是CK的1.17倍。4種腐植酸生防生物有機(jī)肥與CK比較，微生物生物量碳增加了250.35～409.42 mg/kg。不同處理之間的微生物生物量氮無論根際土壤還是非根際土壤也均存在顯著差異，各處理的根際土壤的微生物生物量氮含量為：處理1＞處理2＞處理3＞處理4＞處理5＞處理6＞處理7(CK)，其中處理1最高，達(dá)到186.43 mg/kg，是CK的1.50倍；處理6最低，達(dá)到164.85 mg/kg，是CK的1.32倍。4種腐植酸生防生物有機(jī)肥與CK比較，微生物生物量氮增加了50.63～61.89 mg/kg。不同處理之間的微生物生物量磷無論根際土壤還是非根際土壤均存在顯著差異，各處理的根際土壤的微生物生物量磷含量為：處理1＞處理2＞處理5＞處理4＞處理3＞處理6＞處理7，其中處理1最高，達(dá)到32.17 mg/kg，是CK的2.65倍；其他處理間差異不顯著。4種腐植酸生防生物有機(jī)肥與CK相比較，微生物生物量磷增加了14.30～20.01 mg/kg，說明施用腐植酸生防生物有機(jī)肥更有利于增加土壤微生物的活性和數(shù)量。單獨(dú)施用腐植酸生物有機(jī)肥或普通生物有機(jī)肥也能改善土壤生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)土壤微生物生長繁殖旺盛，增加土壤微生物的數(shù)量，但以腐植酸生物 有機(jī)肥效果較好。

表3 不同處理對土壤微生物生物量的影響Tab.3 Effect of different treatments on soil microbial biomass mg/kg

3 結(jié)論與討論

辣椒根腐病是最為典型的土壤傳播病害，隨著近幾年保護(hù)地種植面積的不斷增加，輪作倒茬越來越困難，病害發(fā)生越來越重，導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量、品種大幅度下降，已成為影響辣椒生產(chǎn)的一大病害。生產(chǎn)上通常采用化學(xué)藥劑防治，但防效不穩(wěn)定，且不理想[23]，生物防治逐漸成為研究熱點(diǎn)。芽孢桿菌、鏈霉菌和木霉菌的生防效果已在香蕉、蘋果、辣椒、黃瓜等作物上做了大量試驗(yàn)研究[24～28]，但總體上還是處于實(shí)驗(yàn)室水平，有關(guān)田間試驗(yàn)和推廣應(yīng)用的報(bào)道不多。生產(chǎn)上，由于受土壤環(huán)境、作物、季節(jié)、栽培方式、施肥、用藥、灌水以及微生物吸附載體等因素的影響，單獨(dú)試驗(yàn)生防菌的防治效果不穩(wěn)定，影響了生防菌劑的推廣和應(yīng)用。將生防菌劑同生物有機(jī)肥，尤其是腐植酸生物有機(jī)肥相結(jié)合，利用其協(xié)同作用增加防效是今后研究和推廣的重點(diǎn)。腐植酸生物有機(jī)肥除兼有腐植酸本身的改土肥田、提高肥效、增強(qiáng)抗逆、刺激生長和改善品質(zhì)功效外，還含有豐富的有益微生物，具有一定的抑制病害的作用，同時(shí)其本身還是生防菌的良好載體。本研究將具有生防作用的枯草芽孢桿菌、涇陽鏈霉菌和康寧木霉與充分腐熟的腐植酸生物有機(jī)肥混合，制成腐植酸生防生物有機(jī)肥，用于辣椒生產(chǎn)，結(jié)果表明，腐植酸生物有機(jī)肥+混合生防菌劑、腐植酸生物有機(jī)肥+康寧木霉、腐植酸生物有機(jī)肥+涇陽鏈霉菌、腐植酸生物有機(jī)肥+枯草芽孢桿菌4個(gè)處理對辣椒根腐病原菌均有良好的抑制作用，顯著降低了辣椒根腐病的病情指數(shù)，提高了防治效果，其中腐植酸生物有機(jī)肥+混合生防菌劑處理效果最好，防治效果達(dá)到93.2%。這可能是由于腐植酸生防生物有機(jī)肥所含有的高效拮抗生防菌在辣椒根際定植后，保護(hù)辣椒根系免受病原菌侵染，從而降低了病情指數(shù)，提高了防治效果。

土壤微生物的種類和數(shù)量與作物病害的防治效果存在一定的相關(guān)性[29，30]，通過調(diào)整土壤微生物結(jié)構(gòu)和群落可以抑制土傳病害。本研究結(jié)果表明，腐植酸生防生物有機(jī)肥能夠顯著影響土壤微生物的數(shù)量，與CK相比較，細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著增多，而真菌數(shù)量有著不同程度的減少，辣椒根腐病原菌(蝕脈鐮孢)的數(shù)量大大減少，這既有生防菌的作用，又有生物有機(jī)肥的作用，還有腐植酸的作用，亦或是“基質(zhì)-載體-菌群”的復(fù)合作用，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

土壤微生物生物量能反映出參與調(diào)控土壤中能量和養(yǎng)分循環(huán)以及有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化對應(yīng)的微生物數(shù)量，是植物生長可利用養(yǎng)分的重要來源[30]。本研究結(jié)果表明，辣椒施用腐植酸生防生物有機(jī)肥后，為微生物活動(dòng)提供了優(yōu)良的生存環(huán)境，顯著增加了根際土壤和非根際土壤的細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，不同程度地減少了真菌的數(shù)量，改善了土壤微生物群落組成，抑制了辣椒根腐病原菌的生長。腐植酸生防生物有機(jī)肥進(jìn)入土壤后，有利于促進(jìn)辣椒生長，增強(qiáng)抗逆性，提高辣椒植株的抗病性能。

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