ErbB－2、PAK1及VEGF 在大腸癌中的關(guān)系及其意義研究

周 青 劉 星 王冬芽

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室；1井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心；2井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，吉安343000）

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）居我國惡性腫瘤死因的第5位，僅次于肺癌、胃癌、肝癌和食管癌。其發(fā)病率和病死率在我國乃至世界逐年上升，且有年輕化的趨勢，嚴(yán)重危害人類的健康［1］。與大多數(shù)惡性腫瘤一樣，大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段共同參與的復(fù)雜生物學(xué)過程。原癌基因ErbB－2是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族的成員之一，在多種惡性腫瘤進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。目前ErbB－2在大腸癌中的表達(dá)及其與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系，正日益受到人們的密切關(guān)注。ErbB－2基因在正常成人一般不表達(dá)，但當(dāng)受到生長因子信號刺激時，它與其他受體形成異源二聚體，磷酸化激活，進(jìn)而與下游信號蛋白識別并結(jié)合，實現(xiàn)逐級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對細(xì)胞增殖與凋亡起重要調(diào)節(jié)［2－5］。p21活化激酶1（p21－activated kinase－1，PAKl），即 Rho 家 族 的 小 GTP 酶（small GTPases），在生長因子介導(dǎo)下，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及細(xì)胞凋亡，目前人類許多腫瘤都已發(fā)現(xiàn)PAKl的高表達(dá)及在腫瘤治療和預(yù)后方面的重要作用［6－10］。但在大腸癌的演化和轉(zhuǎn)移中PAKl的作用機(jī)制尚未明確，以及與ErbB－2的關(guān)系尚未見報道。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)并誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤侵襲［11－14］。因此本研究采用western blot（免疫印跡）方法和 RT－PCR 法（逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)法）檢測ErbB－2、PAK1及VEGF在大腸癌中的mRNA及蛋白表達(dá)，探討三者表達(dá)在大腸癌發(fā)生演進(jìn)中的關(guān)系及其作用機(jī)制，同時分析ErbB－2、PAK1及VEGF與大腸癌組織學(xué)類型、分化程度及Dukes分期等病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，以期為大腸癌的早期診斷、靶向治療及評估預(yù)后提供理論和實驗依據(jù)。

材料和方法

1.一般資料

選取我院結(jié)直腸癌根治術(shù)后病理檢測確診為大腸癌的組織標(biāo)本共48例，分組如下：（1）腸癌組織組，48例，男26例，女22例，年齡31－80歲，中位年齡53歲。同時收集患者的臨床資料，包括組織學(xué)分型、病理學(xué)分級、Dukes分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。（2）癌旁組織組，21例，取上述癌腫患者毗鄰腫瘤旁的腸粘膜組織。（3）遠(yuǎn)癌組織組，12例，取上述癌腫患者腫瘤旁10cm以外的腸粘膜組織。后二組經(jīng)病理證實均無腫瘤浸潤。

2.免疫印跡法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)

取樣品與5×上樣緩沖液混合煮沸5min后上樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳；電泳后以穩(wěn)定18V電壓，半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉TBS／T緩沖液封閉1h，加入一抗，4℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育1h，暗室中ECL發(fā)光液覆蓋膜5min，X光膠片曝光，顯影，定影，PVDF膜上特異性條帶經(jīng)Olympus BX41凝膠成像儀掃描，記錄條帶強(qiáng)度（條帶強(qiáng)度＝條帶面積×條帶密度），作相對定量分析。

3.逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)法檢測基因表達(dá)

按EZ Spin Column RNA Purification Kit說明提取總RNA。核酸蛋白分析儀鑒定RNA樣品的濃度和純度，正常RNA的吸光度（A）260nm／280nm比值均在1.9－2.0。以提取的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后取出cDNA按1：1稀釋，4℃保存。用于real time PCR的三對引物序列由上海生工生物工程公司合成。其中ErbB－2的引物序列為：上游引物：CCTCTGACGTCCATCATCTC，下游引物：ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT；PAK1的引物序列為：上游引物：CGGAAGTAGCGGATCCTGGTGGTGACAATGTC，下游引物：ATCTCACAGAGCTCGAGACAATGAGGCTGG；VEGF的引物序列為：上游引物：CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG ，下游引物：TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC。經(jīng)由40個循環(huán)的變性、退火和延伸，生成的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果用靶基因／β－actin比值表示。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1.ErbB－2、PAK1及VEGF在各組的蛋白表達(dá)

ErbB－2在腸癌組織組的表達(dá)比癌旁組織組明顯增多，癌旁組織組又比遠(yuǎn)癌組織組表達(dá)增多。PAK1在腸癌組織組表達(dá)較癌旁組織組顯著增加，遠(yuǎn)癌組織表達(dá)極低。VEGF在腸癌組織的表達(dá)高于癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織（圖1、表1）。

圖1 ErbB－2、PAK1及 VEGF在各組的蛋白表達(dá)（Western blot法）A腸癌組織組；B癌旁組織組；C遠(yuǎn)癌組織組Fig.1The expression of proteins of ErbB－2，PAK1and VEGF in different groups（Western blot）A group of colorectal carcinoma tissue；B group of pericancerous tissue；C group of distant tissue

表1 ErbB－2、PAK1及VEGF分別在各組的蛋白表達(dá)（）Table 1 The expression of proteins of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

表1 ErbB－2、PAK1及VEGF分別在各組的蛋白表達(dá)（）Table 1 The expression of proteins of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

條帶強(qiáng)度（INT）Band intensity（INT）ErbB－2 PAK1 VEGF A腸癌組織組（Carcinoma tissue） 4 4183232.57±587378.18△△＊ 3879654.12±256332.02△△＊＊4219314.65±433587.02組別 （Group） 掃描次數(shù)（scanning times）△△＊B癌旁組織組（Pericancerous tissue） 4 2283766.18±376455.78△ 1336987.25±98653.20△△ 2275653.51±403731.20 78528.34±387563.71 C遠(yuǎn)癌組織組（Distant tissue） 4 1394280.24±6562.30 126987.30±32101.26 18

2.ErbB－2、PAK1及 VEGF在各組的 mRNA表達(dá)

ErbB－2在腸癌組織組的mRNA表達(dá)明顯高于遠(yuǎn)癌組織組，此外癌旁組織組比遠(yuǎn)癌組織組的表達(dá)有所增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PAK1、VEGF的mRNA表達(dá)在腸癌組織顯著高于癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織，PAK1遠(yuǎn)癌組織幾乎未見表達(dá)（圖2，表2）。

3.腸癌組織中ErbB－2、PAK1及VEGF各自的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)的相關(guān)性

對ErbB－2在腸癌組織中mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明ErbB－2mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系（R＝0.78，P＜0.01）。PAK1在腸癌組織中的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（R＝0.76，P＜0.01），前者表達(dá)較高的標(biāo)本，后者表達(dá)也高。VEGF在腸癌組織中的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)也呈顯著正相關(guān)（R＝0.83，P＜0.01）。

4.腸癌組織中ErbB－2、PAK1及VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性

對腸癌組織中ErbB－2、PAK1及VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩兩之間呈正相關(guān)關(guān)系（表3）。

圖2 ErbB－2、PAK1及VEGF在各組的 mRNA表達(dá)（RT－PCR法）。：A腸癌組織組；B：癌旁組織組；C：遠(yuǎn)癌組織組Fig.2The mRNA expression of ErbB－2，PAK1and VEGF in different groups.A：group of colorectal carcinoma tissue；B：group of percancerous tissues；C：group of distant tissue

表2 ErbB－2、PAK1及VEGF在各組的mRNA表達(dá)）Table 2 The expression ofmRNA of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

表2 ErbB－2、PAK1及VEGF在各組的mRNA表達(dá)）Table 2 The expression ofmRNA of ErbB－2、PAK1and VEGF in different groups

與遠(yuǎn)癌組織組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與癌旁組織組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Compared with group of tissues far from carcinoma（C），△P＜0.05，△△P＜0.01；compared with group of tissues beside carcinoma（B），＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

mRNA ErbB－2 PAK1 VEGF A腸癌組織組（Carcinoma tissue） 53.23±11.25△ 67.20±19.32△△＊＊ 62.30±33.58組別 （Group）△△＊B癌旁組織組（Pericancerous tissue） 38.21±6.20 26.50±7.22△△ 28.22±7.56 30.29±10.20 2.03±0.86 23.33±8.12 C遠(yuǎn)癌組織組（Distant tissue）

表3 大腸癌組織中ErbB－2、PAK1及VEGF的蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 3 The correlation of expression of proteins of ErbB－2、PAK1and VEGF in CRC tissues

5.ErbB－2、PAK1及VEGF的蛋白表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

在48例 Western blot檢測的大腸癌組織中，ErbB－2、PAK1及VEGF的蛋白表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，而與腫瘤的發(fā)生部位、腫瘤形態(tài)及組織學(xué)類型未見明顯相關(guān)（表4）。

討 論

大腸癌起病隱匿，早期常無明顯臨床表現(xiàn)，往往確診時已到中晚期，這是其死亡率居高不下的重要原因。近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，一些蛋白質(zhì)分子生物標(biāo)志物成為腫瘤研究的熱點，應(yīng)用于惡性腫瘤的早期診斷、靶向治療及預(yù)后評估。

人類表皮生長因子受體于1978年被發(fā)現(xiàn)，是一族具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白質(zhì)［15］。該家族成員之一ErbB－2具有固定的晶體構(gòu)象，只有它可與其他受體形成異源二聚體，如EGFR／ErbB－2，ErbB－2／ErbB－3（ErbB－4），含有 ErbB－2的異源二聚體能夠存在更長時間并可以更有效地向下游傳遞信號［16］。自1987年Slamon等首次發(fā)現(xiàn)ErbB－2基因在乳腺癌中存在擴(kuò)增現(xiàn)象以來，近年已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，ErbB－2在卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤的演進(jìn)及靶向治療中產(chǎn)生重要作用［2－5］。而有關(guān)ErbB2在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后方面的意義，近年也引起學(xué)界的密切關(guān)注，但研究結(jié)果不盡一致。國內(nèi)趙東利等［17］報道大腸癌組織 ErbB－2陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織和正常組織，陽性表達(dá)率在Dukes C和D期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯高于Dukes A和B期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；同時他們的體外研究［18］還發(fā)現(xiàn)，ErbB－2基因siRNA重組質(zhì)粒可以通過將細(xì)胞周期阻滯于G0／G1期而明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。近期日本學(xué)者shin IY等［19］用免疫組織化學(xué)法檢測到ErbB－2的陽性表達(dá)率為30.1%，并且認(rèn)為ErbB－2可與 Cathepsin D、P53、COX－2及 Ki－67等分子聯(lián)合作為結(jié)直腸癌的預(yù)后評估指標(biāo)。我們的研究通過western blot法和RT－PCR法觀測到，無論是ErbB－2的mRNA表達(dá)還是蛋白表達(dá)都比遠(yuǎn)癌組織明顯增加（P＜0.01），同時ErbB－2的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示，結(jié)直腸癌中ErbB－2高表達(dá)與腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這與上述報道較為一致。然而另有一些文獻(xiàn)報道ErbB－2在結(jié)直腸癌的蛋白表達(dá)率很低，為0.6%至5%，基因擴(kuò)增率也較低，并且ErbB－2的表達(dá)與結(jié)直腸癌Dukes分期、預(yù)后等均無關(guān)，不能反映浸潤、轉(zhuǎn)移情況［20－22］。曾瑄等認(rèn)為不同的抗體和方法學(xué)以及標(biāo)本的儲存時間（影響染色強(qiáng)度）都可能是造成研究結(jié)果迥異的原因，因此期待于評分系統(tǒng)的統(tǒng)一和更大研究數(shù)據(jù)的積累。

資料顯示，ErbB－2在生長因子作用下形成ErbB2－3／4異二聚體并磷酸化激活后，可與多種下游信號分子特異性識別并結(jié)合，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。若能發(fā)現(xiàn)其下游復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號分子，將對于生長因子－ErbBs的促腫瘤增殖等效應(yīng)的調(diào)節(jié)具有重大意義。PAK1為Rho家族小鳥苷三磷酸酶（Rho－GTPase）Rac1和Cdc42下游重要的靶蛋白，參與了細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)過程，近來研究發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［23－24］。PAKl在大腸癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色也成為學(xué)界研究熱點。Zhu G［25］等發(fā)現(xiàn)PAKl高表達(dá)與重要的細(xì)胞骨架蛋白β－catenin（β－連環(huán)蛋白）的大量堆積呈正相關(guān)，并認(rèn)為Rac1／PAK1級聯(lián)控制了大腸癌細(xì)胞中β－catenin的S675磷酸化及癌細(xì)胞的整體激活。另有研究表示，在CRC細(xì)胞株中敲除PAK1會抑制β－catenin的表達(dá)、β－catenin／TCF4的轉(zhuǎn)錄活性以及原癌基因c－Myc的表達(dá)，阻礙CRC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［26］。同時還有學(xué)者報道，PAK1的敲除能提高CRC對5－氟尿嘧啶的化學(xué)敏感性［27］。

表4 ErbB－2、PAK1及VEGF的表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 4 The relations between expression of ErbB－2，PAK1and VEGF and the clinical pathological parameters in colorectal carcinoma

但是在CRC中PAK1與生長因子及其ErbBs受體的關(guān)系鮮見報道。Arias－Romero LE等［28］在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)了一條ErbB2－PAK1再到β－catenin的重要信號通路，指出這是乳房上皮細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化的有效途徑。我們的研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中PAK1的基因及蛋白表達(dá)均高于癌旁組織及遠(yuǎn)癌組織（P＜0.05）。同時實驗還發(fā)現(xiàn)PAK1與ErbB－2的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。據(jù)此我們推測，在結(jié)直腸癌中，活躍的生長因子激活ErbB－2／3／4受體后，可能通過某種信號通路激活下游重要信號分子PAK1，增強(qiáng)PAK1基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯導(dǎo)致其蛋白過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲。

VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子，而新生血管形成是腫瘤發(fā)展和浸潤的必要條件。眾多資料提示VEGF過表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有重大意義［29－32］。但是有關(guān)PAK1與VEGF在腫瘤演進(jìn)中的相互關(guān)系目前研究較少。有學(xué)者在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PAK1激酶抑制劑K299R的過表達(dá)會抑制VEGF促進(jìn)劑的活化、VEGFmRNA表達(dá)及VEGF蛋白的分泌；相反，PAK1激動劑T423E促進(jìn)VEGF表達(dá)及分泌［33］。武金寶等［34］報道，大腸癌細(xì)胞SW480中，一方面PAK1可正向調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)及活性，另一方面，VEGF發(fā)揮效應(yīng)作用的一個途徑是通過激活PAKl而起效。近年李良輝等［35］也報道，將大腸癌細(xì)胞SWlll6－Pakl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后形成的血管數(shù)較空載體轉(zhuǎn)染組顯著增加，而且，VEGF的蛋白表達(dá)水平在SWlll6－Pakl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株中明顯升高。上述體外研究提示，大腸癌細(xì)胞中PAK1和VEGF的表達(dá)相互促進(jìn)，在大腸癌的演進(jìn)發(fā)展中形成惡性循環(huán)。本研究則從大腸癌患者體內(nèi)的癌組織中觀測到，PAK1與VEGF的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），進(jìn)一步證實在結(jié)直腸癌中PAK1與VEGF可能相互誘導(dǎo)調(diào)節(jié)表達(dá)，促進(jìn)血管生成，加速腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤。

另有體外實驗表明，ErbB－2過表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中能增加VEGF等血管生成因子的合成與分泌，反之，用抗ErbB－2因子治療則導(dǎo)致VEGF合成的顯著下降［36］。近年 Chen J 等［37］報道，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中，ErbB－2及VEGF在肝轉(zhuǎn)移中的陽性表達(dá)率與原發(fā)腫瘤相似，而無論在原發(fā)腫瘤，還是在肝轉(zhuǎn)移中，二者表達(dá)均顯著相關(guān)，并且二者皆表達(dá)陽性者較陰性表達(dá)者預(yù)后更差。我們的研究顯示，大腸癌組織中ErbB－2與VEGF無論是基因表達(dá)還是蛋白表達(dá)均比癌旁組織和遠(yuǎn)癌組織增高，并且ErbB－2與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，提示通過上調(diào)VEGF的表達(dá)促使血管大量生成很可能是ErbB－2在大腸癌浸潤侵襲中發(fā)揮作用的重要途徑。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，結(jié)直腸癌中生長因子受體ErbB－2的活化可能經(jīng)由某信號途徑激活下游分子PAK1及VEGF，后二者又相互協(xié)同誘導(dǎo)表達(dá)，共同促進(jìn)了大腸癌的進(jìn)展遷移，具體信號機(jī)制有待深入研究。此外ErbB－2、PAK1及VEGF的表達(dá)與CRC的病理學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)，提示聯(lián)合檢測ErbB－2、PAK1及VEGF在大腸癌中的表達(dá)對于判定大腸癌生物學(xué)行為及評估預(yù)后具有重要價值，同時說明靶向于ErbB－2、PAK1及VEGF對于CRC化學(xué)治療藥物來說可能代表了一種新的治療策略。

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