FQ-PCR技術(shù)對診斷前驅(qū)期小兒結(jié)核性腦膜炎的臨床可行性及有效性評價

余振興

武漢市醫(yī)療救治中心 武漢 430000

結(jié)核病是人畜共患的慢性傳染病，由結(jié)核分歧桿菌感染引起，給人類健康帶來嚴重威脅。結(jié)核性腦膜炎（TM）是由結(jié)核分歧桿菌引起的腦膜非化膿性炎癥，是慢性腦膜炎的常見類型，且是所有肺外結(jié)核菌感染疾病中最嚴重的［1-2］。TM患者若未經(jīng)治療，將在發(fā)病后4～8周病情加重，直至死亡。近年來，由于抗結(jié)核治療的不規(guī)范，結(jié)核多重耐藥菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致免疫缺陷患者增加等因素使TM的發(fā)病率呈上升趨勢。同時臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣化，診斷難度增加，導(dǎo)致誤診率較高［3］。發(fā)展快速高效診斷TM的技術(shù)可避免因不當治療引起的藥物不良反應(yīng)，并最大程度改善患者預(yù)后，降低TM的致死率和后遺癥發(fā)生率，已成為當前TM控制的當務(wù)之急。本研究通過FQ-PCR檢測34例TM患兒的TB-DNA水平，與結(jié)核涂片的結(jié)果對照，發(fā)現(xiàn)FQ-PCR檢測對TM具有較高的診斷價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012-06—2014-01在我院接受治療的34例TM患兒為觀察組。臨床表現(xiàn)主要為結(jié)核中毒癥狀、顱內(nèi)高壓，以意識障礙、腦膜刺激征、錐體束征、腦神經(jīng)麻痹及癱瘓為常見神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征。男22例，女12例；年齡6個月～4歲，平均（2.4±0.8）歲。有卡介苗接種25例，無卡介苗接種6例，卡介苗接種不詳3例。臨床分期：早期11例，中期14例，晚期9例。入選標準：（1）符合慢性腦膜炎的診斷標準，包括頭痛、發(fā)熱和腦膜刺激征，CSF呈非膿性炎性改變；（2）腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隱球菌墨汁染色陰性；（3）合并活動性肺炎或肺外結(jié)核；（4）影像學檢查發(fā)現(xiàn)顱底腦膜強化、腦積水或顱內(nèi)結(jié)核瘤。排除標準：（1）病歷不全的患兒；（2）合并其他嚴重心、腎、肺等臟器疾病。另選取34例經(jīng)體檢正常排除TM的患兒為對照組，經(jīng)臨床檢查無肝、腎、腦和心臟等疾病。男19例，女15例；年齡8個月～6歲，平均（2.7±0.9）歲。2組患兒性別、年齡和基礎(chǔ)疾病等一般資料相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患兒及家屬簽字同意。

1.2 方法 FQ-PCR法：腦脊液標本以1 500r／min離心5 min，棄上清液，沉淀物中加入50μL TB核酸提取液，輕彈管底3～5次，使沉淀物懸浮。將樣本管放置在30℃10min，隨后放置在4℃冷卻數(shù)分鐘。將樣本管10 000r／min離心5min，吸取上清，將反應(yīng)模板保存在4℃內(nèi)，取2μL模板上清液加入各自動反應(yīng)管供PCR用。結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，F(xiàn)Q-PCR儀購自美國ABI公司。

涂片染色法：對腦脊液標本離心，沉渣涂片抗酸染色，鏡檢找抗酸桿菌。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學整理和分析，計數(shù)資料行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組檢出陽性率比較 2種方法檢出陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FQ-PCR檢測對于TM的診斷具有更高的陽性檢出率。見表1。

表1 2組檢出陽性率比較

2.2 2種檢測方式對TM診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較 2種方法敏感性和陰性預(yù)測值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FQ-PCR檢測對TM具有更高的靈敏性。見表2。

表2 2種檢測方式對TM診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較 （%）

3 討論

腦膜炎是一種腦膜或腦脊膜感染疾病，通常伴細菌或病毒感染。腦膜炎患者大多數(shù)為2歲以下嬰幼兒，多出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛和嘔吐、精神萎靡或愛哭鬧、頸部疼痛等。腦膜炎發(fā)病率、致死率和致殘率均相對較高，嚴重威脅患兒生命安全。且其發(fā)病機制和病理生理過程復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一的解釋［4］。腦膜炎早期臨床表現(xiàn)多樣化，且不典型，病情進展迅速，診斷較為困難，常常在發(fā)生不可逆的神經(jīng)損傷后才被診斷出來。因此，腦膜炎的早期診斷對于其預(yù)后具有重要的價值。

在TM的診斷中，病原體的檢出為確診的金標準，目前常規(guī)的TB檢測方法為抗酸染色涂片法和培養(yǎng)法，抗酸染色涂片雖然簡便易行，但檢出率往往不高，報道顯示，檢出率5%～15%［5-6］。TB培養(yǎng)的檢出率雖然較高，然而其耗時較長，需要1～2個月才能達到預(yù)期效果，即便是快速檢測也需要1周以上，失去了TM早發(fā)現(xiàn)、早治療的良機。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)在方法學上的優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷中［7］。常規(guī)PCR由于存在非特異性、易污染、檢測結(jié)果需要進行溴化乙錠（EB，為強致癌物）染色等原因，造成一定的假陽性和假陰性。FQ-PCR克服了常規(guī)PCR的劣勢，通過加入熒光探針，將核酸擴增、雜交和熒光光譜技術(shù)結(jié)合起來，從而提高了檢出率和敏感性［8］。理論上只要存在一個TB菌，便能將其檢測出來，具有簡便和快速的優(yōu)點，且自動化程度高，對環(huán)境污染小，適于實驗室應(yīng)用［9］。

本次研究我們通過對34例TM患兒采用FQ-PCR檢測TB-DNA水平，并與傳統(tǒng)的涂片染色法比較，發(fā)現(xiàn)FQ-PCR對TM的陽性檢出率明顯更高。本次研究還顯示，F(xiàn)Q-PCR法的敏感性和陰性預(yù)測值高于傳統(tǒng)結(jié)核涂片法，說明FQPCR在TM的診斷中具有一定的價值，而其敏感性仍有待提高，且當TB-DNA陰性時也不能輕易排除TM的診斷。我們認為，本次臨床確診TM患者CSF的TB-DNA陰性的原因主要有以下幾點：（1）TM患者中TB菌株的含量較少；（2）引物和探針設(shè)計未選取最佳的特異性保守片段，細菌DNA特異序列存在部分突變，DNA提取過程中可能出現(xiàn)降解，細胞壁的裂解不完全導(dǎo)致提取的DNA量非常少，不能滿足PCR擴增模板濃度的要求；（3）患兒接受的抗結(jié)核治療起效，標本選取時間滯后，本組12例患兒是在抗結(jié)核治療實施后才抽取的CSF，而抗結(jié)核效果顯著也是TB-DNA陰性的原因之一。針對FQ-PCR敏感性不高的問題，部分學者認為可進行連續(xù)多次PCR以提高敏感性和檢出率，從而提高診斷的可靠性。因此，臨床醫(yī)師在依據(jù)患者臨床癥狀和體征表現(xiàn)，高度懷疑患者為TM時，可進行早期、連續(xù)的FQ-PCR以提高檢出率。

綜上所述，F(xiàn)Q-PCR對TM具有重要的診斷價值，敏感性高且特異性強，值得臨床進一步推廣。但仍然需要尋找對TM更為敏感的診斷方式。

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