shRNA靶向干擾Notch2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87生長(zhǎng)的體外研究

李學(xué)真 何 心 王建禎（通訊作者）

1）首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科 北京 100050 2）首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京三博腦科醫(yī)院神經(jīng)外科 北京 100093 3）武警總醫(yī)院神經(jīng)外科 北京 100039

Notch信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的細(xì)胞間信號(hào)調(diào)節(jié)傳導(dǎo)系統(tǒng)，通過(guò)特異的信號(hào)上下級(jí)聯(lián)作用影響細(xì)胞的增殖［1］。研究表明，Notch信號(hào)在膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要的作用［2-6］。但Notch信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用還不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Notch2shRNA干擾質(zhì)粒和相同載體的無(wú)意義序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，觀察U87細(xì)胞株中Notch2蛋白表達(dá)持久抑制后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，在青霉素和鏈霉素100U／mL的10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基中37℃、5%CO2以1×105／mL的接種密度接種24孔培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectin 2000操作規(guī)程進(jìn)行。同時(shí)轉(zhuǎn)染并篩選pGFP-V-RS質(zhì)粒無(wú)關(guān)序列組作為對(duì)照。篩選成功后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況。

1.2 RT-PCR檢測(cè)基因沉默效果 Notch2和GAPDH引物序列：Notch2，上 游：5＇-CCCAATGGGCAAGAAGTCTA-3＇，下游：5＇-CACAATGTGGTGGTGGGATA-3＇；GAPDH：上游：5-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3，下 游：5-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3Notch2，30個(gè)循環(huán)，GAPDH 25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后紫外線下拍照比較各組灰度變化。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線測(cè)定（MTT法） 取3組細(xì)胞接種于96孔板，3 000個(gè)細(xì)胞／孔，每日在相同時(shí)間加入噻唑蘭（MTT），連續(xù)1周，孵育4h離心，加入（DMSO）二甲基亞砜并振蕩數(shù)分鐘，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A 490值繪制生長(zhǎng)抑制曲線。

1.4 蛋白免疫印跡（Westen blot） 收集各組細(xì)細(xì)胞提取蛋白，Westen blot檢測(cè)干擾組與轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組和未轉(zhuǎn)染組間Notch2蛋白及其活性片段Notch2IC的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期相關(guān)蛋白p21、p27、CyclinD1和MCM2的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Image-proplu（sversion5.0.2.9）軟件分析圖像，測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)區(qū)累積光密度，SPSS 13.0軟件完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以±s表示，采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pGFP-V-RS Notch2shRNA能有效抑制Notch2的表達(dá) RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，U87細(xì)胞中存在Notch2RNA及蛋白水平的表達(dá)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS Notch2shRNA后，與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列組相比Notch2在RNA（圖1A）及蛋白水平（圖1B）均發(fā)生顯著抑制

2.2 pGFP-V-RS Notch2shRNA能有效影響U87細(xì)胞增殖、周期及相關(guān)蛋白表達(dá) MTT結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列組比較，干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，見(jiàn)圖2A。干擾組細(xì)胞S期細(xì)胞所占百分比明顯降低，G1期細(xì)胞所占百分比明顯升高，而組間G2期細(xì)胞所占百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)圖2B、C。Western blot結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列組比較MCM2蛋白、CyclinD1蛋白在干擾組中明顯受到抑制，p21蛋白水平增高。

3 討論

研究中我們首先檢測(cè)了U87細(xì)胞中Notch2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Notch2在U87細(xì)胞中存在RNA及蛋白水平的表達(dá)，這與Chen、Sivasankaran和Reichrat等［7-9］的研究結(jié)果相似。但Reichrath、Chen等［7-8］研究表明，Notch2受體在U87等不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株表達(dá)存在差異。Xu等［10］也認(rèn)為，在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中和髓母細(xì)胞瘤中Notch2蛋白表達(dá)水平顯著不同，但與Chen等研究不同，Xu等認(rèn)為U87中Notch2受體呈低表達(dá)［11-12］。由此可見(jiàn)，Notch2在不同膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平存在差異，說(shuō)明Notch2在不同類(lèi)型膠質(zhì)瘤中發(fā)揮的作用也存在差異。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Notch2受體與膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87的增殖密切相關(guān)，干擾組細(xì)胞增殖顯著減慢。Chen等［6］研究也表明，下調(diào)Notch2的表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87的體外增殖。Chen等［8］認(rèn)為抑制Notch1和Notch2的表達(dá)均能使U87、U87細(xì)胞體外增殖減弱，其中抑制Notch2產(chǎn)生的細(xì)胞增殖抑制作用更加顯著。但與以上研究不同F(xiàn)an、Xu等［5-6，11-12］認(rèn)為，Notch2能夠拮抗Notch1的作用從而抑制瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87中增強(qiáng)Notch2的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖。根據(jù)這些研究我們推測(cè)，Notch2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的作用可能是雙重性，Notch2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中適度表達(dá)，增強(qiáng)或抑制Notch2的表達(dá)都會(huì)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的增殖；另外，部分學(xué)者的研究還缺乏體內(nèi)研究的證據(jù)［6-7］。本研究證實(shí)，Notch2敲底后對(duì)膠母細(xì)胞瘤株U87的增殖揮顯著抑制作用，為Notch信號(hào)在膠質(zhì)瘤中的作用研究提供了有力的證據(jù)。

Notch信號(hào)的下游通路的組成復(fù)雜，本研究表明，U87細(xì)胞株中Notch2蛋白被敲低后，細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例顯著降低，Western blot分析顯示細(xì)胞周期相關(guān)蛋白MCM2、CyclinD1表達(dá)降低，p21表達(dá)升高。很多研究表明在不同種類(lèi)細(xì)胞中Notch信號(hào)的下游的效應(yīng)蛋白也不盡相同，在小細(xì)胞肺癌中Notch信號(hào)激活能夠上調(diào)p21和p27的表達(dá)使細(xì)胞周期停滯［8］。在鼠角化細(xì)胞中，Notch信號(hào)通過(guò)CSL依賴(lài)的上調(diào)p21表達(dá)抑制細(xì)胞周期［4］。最近的一項(xiàng)研究表明，Notch信號(hào)通路能夠下調(diào)MCM2和MCM6表達(dá)阻滯細(xì)胞周期［13］。與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似，本研究表明在U87細(xì)胞中Notch2敲底介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制，是通過(guò)改變細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但Notch2對(duì)U87細(xì)胞遷移、侵襲的影響以及調(diào)控細(xì)胞周期的精確機(jī)制還需更深入研究。

圖1 Notch2-shRNA抑制U87細(xì)胞株中Notch2RNA及蛋白水平表達(dá)A：與未轉(zhuǎn)染組與無(wú)意義序列組相比，干擾組Notch2RNA顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝30.0，＊P＜0.01）；B：未轉(zhuǎn)染組與無(wú)意義序列組相比，干擾組Notch2蛋白顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝29.3，＊P＜0.01）

圖2 pGFP-V-RS Notch2shRNA能有效抑制U87細(xì)胞增殖的體外研究A：與無(wú)意義序列組和未轉(zhuǎn)染組相比干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，從培養(yǎng)第4天開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝18.9，P＝0.00＜0.05）；B、C：與無(wú)意義序列組和未轉(zhuǎn)染組相比，干擾組細(xì)胞S期細(xì)胞所占百分比明顯降低（F＝40.02，P＝0.000）；G1期細(xì)胞所占百分比明顯升高（F＝43.55，P＝0.000）；而組間G2期細(xì)胞所占百分比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.28，P＝0.76）。D、E：Western blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和無(wú)意義序列組比較MCM2蛋白、CyclinD1蛋白在干擾組中明顯受到抑制，p21蛋白水平增高（F＝23.6，P＝0.000；F＝10.56，P＝0.004；F＝19.24，P＝0.001）

［1］Claus EB，Black PM.Survival rates and patterns of care for patients diagnosed with supratentorial low-grade gliomas：data from the SEER program，1973-2001［J］.Cancer，2006，106（6）：1 358-1 363.

［2］Anastas JN，Moon RT.WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（1）：11-26.

［3］Ramdass B，Maliekal TT，Lakshmi S，et al.Coexpression of Notch1and NF-kappaB signaling pathway components in human cervical cancer progression［J］.Gynecol Oncol，2007，104（2）：352-361.

［4］Rangarajan A，Hong SJ，Gifford A，et al.Species-and cell typespecific requirements for cellular transformation［J］.Cancer Cell，2004，6（2）：171-183.

［5］Fan X，Mikolaenko I，Elhassan I，et al.Notch1and notch2have opposite effects on embryonal brain tumor growth［J］.Cancer Res，2004，64（21）：7 787-7 793.

［6］Chen L，Zhang R，Li P，et al.P53-induced microRNA-107inhibits proliferation of glioma cells and down-regulates the expression of CDK6and Notch-2［J］.Neurosci Lett，2013，534：327-332.

［7］Reichrath S，Muller CS，Gleissner B，et al.Notch-and vitamin D signaling in 1，25（OH）2D3-resistant glioblastoma multiforme（GBM）cell lines［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2010，121（1／2）：420-424.

［8］Chen J，Kesari S，Rooney C，et al.Inhibition of notch signaling blocks growth of glioblastoma cell lines and tumor neurospheres［J］.Genes Cancer，2010，1（8）：822-835.

［9］Sivasankaran B，Degen M，Ghaffari A，et al.Tenascin-C is a no-vel RBPJkappa-induced target gene for Notch signaling in gliomas［J］.Cancer Res，2009，69（2）：458-465.

［10］Xu P，Yu S，Jiang R，et al.Differential expression of Notch family members in astrocytomas and medulloblastomas［J］.Pathol Oncol Res，2009，15（4）：703-710.

［11］Xu P，Zhang A，Jiang R，et al.The different role of Notch1and Notch2in astrocytic gliomas［J］.PLoS One 2013，8（1）：e53654.

［12］Xu P，Qiu M，Zhang Z，et al.The oncogenic roles of Notch1in astrocytic gliomas in vitro and in vivo［J］.J Neurooncol，2010，97（1）：41-51.

［13］Noseda M，Karsan A.Notch and minichromosome maintenance（MCM）proteins：integration of two ancestral pathways in cell cycle control［J］.Cell Cycle，2006，5（23）：2 704-2 709.