EphrinA1-PE38／GM-CSF殼聚糖納米粒治療荷膠質(zhì)瘤鼠原位激活樹突狀細(xì)胞研究

李 明陳志民吳中華孫 勇王 斌史錫文韓雙?。ㄍㄓ嵶髡撸?/p>

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 1）神經(jīng)外科 2）中心實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450003

殼聚糖（chitosan）是從甲殼類生物的貝殼中提取出來的一種可生物降解的多糖，具有良好的生物相容性，對包裹的分子有很好的結(jié)合和保護(hù)作用，對生物體無毒、相容性好，且很容易制成不同途徑給藥的基因治療載體［1］。在表面覆蓋吐溫-80的納米微粒，能很好地透過血-腦屏障，對顱內(nèi)腫瘤治療具有很好前景。值得注意的是，納米粒能夠用配體進(jìn)行表面修飾，如抗體片段，可進(jìn)行靶向治療。EphA2屬于受體酪氨酸激酶家族，EphrinA1是其特異性的配體。在成人各種正常上皮細(xì)胞中，EphA2幾乎不表達(dá)，在能夠形成血管的膠質(zhì)瘤中EphA2高表達(dá)明顯［2］。以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療是一種非常有前景的新療法，具體做法是使DCs負(fù)載腫瘤相關(guān)抗原，有效激發(fā)機(jī)體CTLs的抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞的目的。本研究內(nèi)容主要為高性能殼聚糖包裹EphrinA1結(jié)合綠膿桿菌毒素PE38殺傷膠質(zhì)細(xì)胞瘤血管生長造成腫瘤缺血、缺氧性壞死，同時聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)劑GM-CSF在體內(nèi)完成DCs抗原負(fù)載并產(chǎn)生DCs疫苗。

1 材料與方法

1.1 主要溶液的配制 本實(shí)驗(yàn)由鄭州大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施，乙酸溶液的配制：取0.3mL乙酸溶于100 mL消毒去離子水，配制成0.3%，v／v。殼聚糖液的配制：取100mg殼聚糖溶于50mL上述乙酸溶液，配制成0.2%，w／v，用0.22Lm消毒小濾器過濾。

1.2 PE38殼聚糖納米顆粒制備

1.2.1 PE38殼聚糖溶液的配制：PE38溶于殼聚糖液，以空白殼聚糖液作為對照，在核酸蛋白檢測儀測得PE38濃度為2.866mg／mL，2.693A260、2.358A280、A280／A260＜1.5，蛋白 濃 度（mg／mL）＝1.55A280-0.75A260＝1.84mg／mL。

1.2.2 PE38殼聚糖納米粒的制備：取0.2mL TPP液加入0.5mL PE38殼聚糖液，室溫，高速振蕩，自動形成乳白色懸液，置于37℃的恒溫振蕩箱中，反應(yīng)時間12h，然后使用高速離心機(jī)以13 000r·min-1的速度離心30min。采用細(xì)胞破碎儀將收集的納米粒分散到10mL的水中，分批加入過量的硼氫化鈉，反應(yīng)時間10h，得到穩(wěn)定的NPs。經(jīng)離心分離、超聲分散、透析等處理，將其中的硼氫化鈉和STPP去除。取1mL的粒子經(jīng)冷凍干燥后計算粒子濃度，調(diào)節(jié)粒子濃度直至達(dá)到10mg／mL以備用。

1.3 PE38-NPs的EphrinA1修飾 量取5mL 10mg／mL的NPs，加入到1mL 5mg／mL的EphrinA1溶液中，然后加入25mg的EDC，反應(yīng)時間1h，即得到EphrinA1修飾的納米粒。將該粒子溶液于13 000r·min-1轉(zhuǎn)速下離心30min。沉淀重新超聲分散后備用。

GM-CSF修飾EphrinA1修飾的NPs：量取2.5mL 10 mg·mL-1EphrinA1修飾的NPs，加入25mg GM-CSF，室溫條件下反應(yīng)時間4h。使用截留分子量14 000的透析袋透析，將未反應(yīng)的PEG去除，得到PEG和FA修飾的NPs。

粒徑和Zeta電位表征：取制備好的NPs以純水稀釋到1 mg·mL-1，然后進(jìn)行粒徑和電位分析。

1.4 荷瘤大鼠模型的構(gòu)建及干預(yù) 成年的C6大鼠購自于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，并生長于無菌的飼養(yǎng)環(huán)境中。用RPMI-1640和胎牛血清培養(yǎng)C6細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長至80%～95%融合時，以0.25%的胰酶消化2～3min，然后采用胎牛血清中止，加PBS液調(diào)整細(xì)胞懸液密度（1～5）×1010個／mL。在無菌條件下，取0.5mL注射至Wistar大鼠皮層，緩慢注射并留針3min。動物生長10d后模型構(gòu)建成功，動物隨機(jī)分為4組：正常對照組（A組，n＝50），生理鹽水組（B組，50μg生理鹽水，n＝50），口服組（C組，50μg納米粒，n＝50）和靜脈注射組（D組，50μg納米粒，n＝50），從第10天開始，每3天重復(fù)1次相應(yīng)的處理。

1.5 荷瘤大鼠的生存率的測定 為了解腫瘤生長過程中生長情況，每個時間點(diǎn)處理5只動物，一旦動物處死后，游標(biāo)卡尺并測量腫瘤的最大直徑和最大寬徑。

1.6 免疫熒光和免疫組化 第13天時4組動物分別取3只戊巴比妥過量麻醉處死，分離腦組織，4℃多聚甲醛固定24h，放置于20%蔗糖溶液中，當(dāng)腦組織沉于容器底部，作連續(xù)冰凍狀片，片厚25μm，每5張片子取一張進(jìn)行免疫組化或免疫熒光染色，為鑒別腫瘤組織表達(dá)的GFAP，常規(guī)免疫熒光染色，一抗分別為羊抗GFAP，二抗為兔抗羊IgG-GFP；為計數(shù)腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，常規(guī)免疫組化染色，一抗分別為羊抗CD31（1∶200），DAB顯色。

1.7 檢測引流淋巴結(jié)、脾臟中活化DC的比例 （CD11c＋和CD86＋）為檢測到活化的樹突狀細(xì)胞，處死大鼠后分別取頸部淋巴結(jié)、脾臟組織，剪刀剪碎，碾磨，300目濾網(wǎng)過濾，常規(guī)流式細(xì)胞儀（FACS Calibur）檢測活化引流淋巴結(jié)和脾臟中CD11c＋和CD86＋的比例。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)（單因素或雙因素）或ANOVA（多因素）檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建質(zhì)粒真核細(xì)胞的表達(dá) 制備得到的納米粒子是一種淡黃色帶乳光溶液。雖然制備的納米粒不是十分規(guī)則，但在掃描電鏡中觀察到粒徑均在200nm以下，見圖1。

圖1 制備的殼聚糖納米粒電鏡照片

EphrinA1、GM-CSF修飾對Zeta電位產(chǎn)生了強(qiáng)烈的影響，EphrinA1、GM-CSF修飾后Zeta電位下降十分明顯，見圖2。

2.2 腫瘤體積 4組大鼠均無死亡情況發(fā)生。隨著C6細(xì)胞植入時間的延長，腫塊組織逐漸增大，倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞生長良好。植入腫瘤細(xì)胞至第9天可見，形成約0.5cm3的腫塊組織。干預(yù)3d后，注射納米粒組、口服納米組大鼠的腫瘤體積明顯小于其他2組，以后各個時間點(diǎn)此情況更加明顯。見圖3。

圖2 不同修飾后納米粒電位

圖3 不同組腫瘤體積大小

2.3 免疫組化 腫瘤組織GFAP染色陽性，同時可見PE38毒素蛋白分散在血管周圍（圖4A～C）。部分腫瘤組織細(xì)胞核明顯萎縮、壞死（圖4D），CD31作為腫瘤血管的一個標(biāo)記物，各組均見CD31呈陽性表現(xiàn)（圖4E～H），靜脈注射納米粒組CD31陽性明顯減少（圖4I）。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測DCs的數(shù)量及活化DC的比例 正常對照組、生理鹽水組、口服納米粒組組、靜脈注射納米粒組CD11＋和CD86＋雙標(biāo)術(shù)后8d較術(shù)前高，以后8、15、22、29d各個時間點(diǎn)，逐步下降，但較其他3組仍較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖5。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，殼聚糖包被的EphrinA1-PE38／GMCSF納米粒能有效殺傷膠質(zhì)細(xì)胞瘤血管生長造成腫瘤的壞死，同時體內(nèi)促進(jìn)局部引流淋巴結(jié)及脾臟中樹突狀細(xì)胞活化，相當(dāng)于體內(nèi)形成原位樹突狀細(xì)胞疫苗。動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，此納米?？捎行岣吆闪鰟游锬Ｐ偷纳鏁r間。EphrinA1、GM-CSF分子鏈上沒有可以電離的基團(tuán)，修飾后一般只能使Zeta電位的絕對值下降，表明此納米粒構(gòu)建成功。納米粒能否通過血腦屏障是本實(shí)驗(yàn)的一個中心焦點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中，我們可在腫瘤血管周圍檢測出毒素蛋白，而在其余腦組織及肝腎等組織中尚無檢測到，說明經(jīng)殼聚糖包被的的納米粒能有效透過血腦屏障［3］，并可以充分發(fā)揮其毒素作用。另外，膠質(zhì)瘤本身可以破壞部分血腦屏障，這也是此納米粒能有效達(dá)到腫瘤周圍的一個重要因素。

腦組織是一個免疫特免部位，無完整的淋巴系統(tǒng)和正常的淋巴引流，樹突狀細(xì)胞細(xì)胞能否有效殺傷膠質(zhì)瘤是本次研究順利進(jìn)行的一個焦點(diǎn)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腦組織中缺乏DCs，但只是相對而言，多種病理情況下血-腦屏障受到破壞，淋巴細(xì)胞可以進(jìn)入中樞發(fā)揮免疫作用。雖然腦內(nèi)缺乏結(jié)構(gòu)完整的淋巴管，但腦脊液與頸部淋巴結(jié)之間存在聯(lián)系。且越來越多的證據(jù)表明，腦組織中存在DCs或DCs的前體細(xì)胞，其可能來源于外周血，也可能由腦組織中的細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。我們有理由相信，抗血管治療腦膠質(zhì)瘤，不但破壞了“免疫特赦”屏障，同時也激活了潛伏在腦血管周圍和蛛網(wǎng)膜下腔起免疫監(jiān)視作用的T淋巴細(xì)胞，通過原位細(xì)胞免疫達(dá)到了靶向性腫瘤殺滅效應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)治療后荷瘤大鼠的頸部淋巴結(jié)可通過流式細(xì)胞儀雙標(biāo)檢測到樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志物（CD11c、CD86＋），分析顯示干預(yù)前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步驗(yàn)證了樹突狀細(xì)胞可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。

圖4 靜脈注射組腫瘤組織血管周圍分布（A-C），靜脈注射組可見腫瘤組織的細(xì)胞核皺縮（D），不同組CD31染色陽性的表現(xiàn)（E-H），并細(xì)胞計數(shù)（I）

圖5 不同組活化樹突狀細(xì)胞陽性細(xì)胞的計數(shù)

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