載脂蛋白E基因與腦血管淀粉樣變對(duì)高血壓腦出血的影響

羅仁國(guó) 印曉鴻 范 杰 段 劼 楊彬彬 唐曉平

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 南充 637000

高血壓腦出血（hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH）是一種常見(jiàn)的腦血管病，具有高病死率和致殘率等特點(diǎn)，其發(fā)生與腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦淀粉樣變血管病、血液病、動(dòng)脈瘤等有關(guān)。大腦淀粉樣血管?。╟erebral amyloid angiopathy，CAA）是由于淀粉樣蛋白（其中最常見(jiàn)的是β淀粉樣蛋白）在大腦血管壁沉積并不斷替代平滑肌層，導(dǎo)致血管壁損害破裂出血及其他血管病變，進(jìn)而導(dǎo)致腦出血。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是體內(nèi)一種十分重要的載脂蛋白，可在血漿膽固醇和甘油三酯的代謝過(guò)程中發(fā)揮作用，還通過(guò)影響β淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）在血管壁在沉積，發(fā)生CAA。本研究通過(guò)對(duì)高血壓腦出血患者及正常人進(jìn)行ApoE的多態(tài)性分析，并檢測(cè)Aβ的表達(dá)，探討ApoE及Aβ在高血壓腦出血發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013-06—2014-06我院住院治療的HICH患者300例，男165例，女135例，平均年齡（48.65±6.74）歲；所有患者均具有詳細(xì)且完整的病史，排除腎功能不全、腎病綜合征、甲狀腺疾病、肝硬化以及腫瘤等可能影響血脂蛋白代謝的疾病。對(duì)照組為我院體檢中心體檢的正常成人150例，男82例，女68例，平均年齡（47.78±7.24）歲。

1.2 方法 所有研究對(duì)象均隔夜禁食＞12h，次日清晨空腹抽靜脈血后并加EDTA抗凝，常規(guī)提取DNA、RNA進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)以及β淀粉樣蛋白的半定量檢測(cè)。取經(jīng)手術(shù)治療的高血壓腦出血患者血腫周?chē)鷼p腦組織標(biāo)本，進(jìn)行H-E染色及剛果紅染色并觀察。

1.2.1 ApoE基因檢測(cè)：采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（PCR-RFLP）檢測(cè)2組ApoE基因。首先，提取基因組DNA，采用PCR法擴(kuò)增取ApoE基因片段，按照文獻(xiàn)［1］對(duì)ApoE基因進(jìn)行分型，分析ApoE的多態(tài)性選取ApoE基因包含編碼第112位和158位氨基酸的一段基因序列，擴(kuò)增引物：F4：5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’；F6：5’TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物為244bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶HhaI過(guò)夜處理后，產(chǎn)物再用非變性丙烯酰胺凝膠電泳分離、染色顯色后觀察并拍照。

1.2.2 β淀粉樣蛋白前體的半定量檢測(cè)：β淀粉樣蛋白主要由淀粉樣B蛋白前體（Aβ16-17）水解產(chǎn)生，參照文獻(xiàn)［2］，以人類(lèi)紅細(xì)胞β血影蛋白基因?yàn)閰⒄漳０?，為gApp，樣本RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增后稱為cApp，對(duì)cApp及gApp競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR，計(jì)算出gApp及cApp的DNA條帶光密度值，求得兩光密度值的比值log值，以競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR不同濃度值為X軸，兩光密度值得log值為Y軸，作直線回歸分析，計(jì)算出相對(duì)cApp的相對(duì)半定量值。

1.2.3 β淀粉樣蛋白染色：H-E染色，先固定切片，二甲苯脫水透明，石蠟包埋，乙醇脫蠟染色，蘇木精水溶液染色；鹽酸酒精與氨水分色；酒精伊紅染色液染色；脫水透明；封片后觀察。剛果紅染色，石蠟包埋，切片脫蠟染色，甲醇剛果紅染液染色，堿性乙醇分化液分化至不再褪色，蘇木素淡復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明封片后觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ApoE基因型分布及等位基因頻率通過(guò)Hardy-Weingerg平衡定律進(jìn)行群起平衡驗(yàn)證，計(jì)量資料采用±s表示，計(jì)量資料數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦出血組標(biāo)本觀察 CAA主要累及大腦皮質(zhì)和軟腦膜中小動(dòng)脈及毛細(xì)血管。顯微鏡下可見(jiàn)中小動(dòng)脈壁及毛細(xì)血管壁的中層和外膜有淀粉樣物沉積，尤其在鄰近外膜的外表面，嚴(yán)重時(shí)血管壁中層彈力層消失，進(jìn)而完全被淀粉物取代。淀粉樣沉積物在H-E染色時(shí)呈非結(jié)晶嗜伊紅物質(zhì)，而用剛果紅染色后顯微鏡下淀粉樣物質(zhì)呈桔紅色改變，偏振光顯微鏡下呈黃綠色雙折射光。

2.2 ApoE基因型頻率及等位基因頻率分布 研究發(fā)現(xiàn)，腦出血組基因型頻率分布以ε3／ε3、ε3／ε4基因型最多，分別為23.67%、26.33%，而ε4／ε4與ε2／ε4基因型次之，ε2／ε2與ε2／ε3基因型最少。正常對(duì)照組ε3／ε3基因型最多，ε4／ε4最少，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)腦出血組ε3／ε3、ε4／ε4、ε2／ε4及ε3／ε4基因型與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。研究等位基因頻率發(fā)現(xiàn)，腦出血組ApoEε2基因較正常對(duì)照組增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），腦出血組ApoEε3基因（75.33%）較對(duì)照組減少（41.83%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），腦出血組ApoEε4基因較正常對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表1 2組ApoE基因型頻率 （%）

表2 2組ApoE等位基因頻率 （%）

2.3 2組不同apoE等位基因間Aβ表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)，ApoE基因的不同等位基因?qū)δX出血組Aβ的表達(dá)均較對(duì)照組增加，其中ε4基因?qū)δX出血組Aβ表達(dá)影響最大，為（3.43±0.70）pmol／g，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。ApoEε3基因?qū)δX出血組Aβ的表達(dá)次之，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），ApoEε3基因?qū)δX出血組的Aβ表達(dá)最少，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，ApoE等位基因間Aβ表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 ApoE等位基因與Aβ16-17水平比較 （±s，pmol／g）

表3 ApoE等位基因與Aβ16-17水平比較 （±s，pmol／g）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.01；ApoE等位基因間比較，P＞0.05

組別 n ε2 ε3 ε 4腦出血組300 3.24±0.52＊3.28 ±0.62 ＊3.32 ±0.61 ＊對(duì)照組150 2.42±0.43 3.44±0.54 3.02±0.45

3 討論

血管淀粉樣變高血壓腦出血，顯微鏡下可見(jiàn)血管壁的中層和外膜有淀粉樣物沉積，嚴(yán)重時(shí)血管壁中層彈力層消失，進(jìn)而完全被淀粉物取代。淀粉樣沉積物在H-E染色時(shí)呈非結(jié)晶嗜伊紅物質(zhì)，而用剛果紅染色后顯微鏡下淀粉樣物質(zhì)呈桔紅色改變，偏振光顯微鏡下呈黃綠色雙折射光。

ApoE基因位于第19號(hào)染色體上，同一位基因點(diǎn)上有3個(gè)等位基因ε2、ε3、ε4，其編碼的蛋白ApoE2、ApoE3、ApoE4［3］，區(qū)別在于112位半胱氨酸的和158位的精氨酸，ApoE2兩個(gè)位點(diǎn)上編碼均為半胱氨酸，ApoE4兩個(gè)位點(diǎn)編碼均為精氨酸，而ApoE3則112位為半胱氨酸，158位為精氨酸。ApoE最初于正常人極低密度脂蛋白中發(fā)現(xiàn)，在肝臟細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞合成后分泌至血漿，通過(guò)受體中介，主要存在于乳糜微粒、乳糜微粒殘基、極低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白中，參與脂蛋白代謝并起重要作用［4］。ApoE4及ApoE3能通過(guò)與低密度脂蛋白受體結(jié)合，而與升高血漿中膽固醇及低密度脂蛋白相關(guān)［5］，ApoE2雖然可與低密度脂蛋白結(jié)合，但結(jié)合活性很低，從而形成高脂蛋白血癥。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血組基因型頻率分布以ε3／ε3、ε3／ε4基因型最多，ε2／ε2、ε2／ε3基因型最少，通過(guò)研究等位基因發(fā)現(xiàn)，等位基因ε3表達(dá)頻率較正常組明顯降低，而ε4表達(dá)頻率較正常組明顯升高，等位基因ε較對(duì)照組增高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明等位基因ε4可能為高血壓腦出血的危險(xiǎn)因子，等位基因ε3可能為高血壓腦出血的保護(hù)因子，而等位基因ε2對(duì)高血壓腦出血的作用尚未明確，與江震欽等［6］研究結(jié)果相似。

淀粉樣腦血管病由于淀粉樣蛋白（常為β淀粉樣蛋白，Aβ）在大腦血管壁沉積并不斷替代平滑肌層，形成血管壁纖維蛋白樣壞死，微血管擴(kuò)張，導(dǎo)致血管壁損害破裂出血［7］。β淀粉樣蛋白是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）蛋白水解作用而產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，ApoE能與Aβ結(jié)合，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白的合成，形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過(guò)對(duì)不同等位基因的連接能力對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ApoE4具有很強(qiáng)的連接能力，能促進(jìn)淀粉樣蛋白形成，而沉積于血管壁，與文獻(xiàn)［8-10］報(bào)道相似。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血組ε4基因?qū)δX出血Aβ16-17影響最大，其表達(dá)水平最高，而ε3基因能降低腦出血組Aβ16-17的表達(dá)，腦出血表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，ε2基因亦能促進(jìn)腦出血組Aβ16-17的表達(dá)。

綜上，通過(guò)對(duì)ApoE的基因型頻率分布、不同等位基因頻率分布以及APP的研究發(fā)現(xiàn)，ApoE能通過(guò)影響APP的代謝，使淀粉樣蛋白沉積于血管壁，形成血管壁纖維蛋白樣壞死，微管擴(kuò)張，導(dǎo)致血管壁損害破裂出血，其中Apoε4基因?qū)δX出血的影響最大，為腦出血危險(xiǎn)因子，而Apoε3基因?yàn)槟X出血的保護(hù)因子，Apoε2基因能影響淀粉樣蛋白的代謝而促進(jìn)腦出血，但其與腦出血的影響無(wú)明顯相關(guān)性，可能與Apoε2基因還可能通過(guò)其他途徑起保護(hù)作用相關(guān)，其功能有待進(jìn)一步研究。雖然ApoE及腦血管淀粉樣變對(duì)腦出血有影響，但ApoE以及腦血管淀粉樣變影響腦出血的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Hixson JE，Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HHAI［J］.J Lipid Res，1990，31（3）：545-548.

［2］張偉，譚蘭，江三多.老年性癡呆中載脂蛋白E與淀粉樣β蛋白前體的關(guān)系［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2007，27（3）：268-270.

［3］Weisgraber KH，Rall SC Jr，Mahley RW.Human E apoprotein heterogeneity.Cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms［J］.J Biol Chem，1981，256（17）：9 077-9 083.

［4］Han X.The role of apolipoprotein E in lipid metabolism in the central nervous system［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61（15）：1 896-1 906.

［5］Lendon CL，Han BH，Salimi K，et al.No effect of apolipoprotein E on neuronal cell death due to excitotoxic and apoptotic agents in vitro and neonatal hypoxic ischaemia in vivo［J］.Eur J Neurosci，2000，12（7）：2 235-2 242.

［6］江震欽，張國(guó)忠.載脂蛋白E基因型多態(tài)性與青年高血壓性腦出血［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（29）：110-111.

［7］Yamada M，Itoh Y，Suematsu N，et al.Vascular variant of Alzheimer＇s disease characterized by severe plaque-like beta protein angiopathy［J］.Dement Geriatr Cogn Disord，1997，8（3）：163-168.

［8］Reid RT，Sabbagh MN，Thal LJ.Does apolipoprotein E（Apo-E）genotype influence nicotinic receptor binding in Alzheimer＇s disease［J］.J Neural Transm，2001，108（8／9）：1 043-1 050.

［9］Sorli JV，Velert R，Guillen M，et al.Effects of the apolipoprotein E polymorphism on plasma lipid levels and cardiovascular disease risk in a Mediterranean population［J］.Med Clin（Barc），2002，118（15）：569-574.

［10］Hatcher JP，Virley D，Hadingham SJ，et al.The behavioural effect of middle cerebral artery occlusion on apolipoprotein-E deficient mice［J］.Behav Brain Res，2002，131（1／2）：139-149.