大鼠腦室出血后腦干藍斑內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元表達變化的研究

吳 勇 譚 華 李小剛（通訊作者）

瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 瀘州 646000

腦室出血分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，以后者常見。既往研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后腦組織中NE含量增高，因此，推測腦室出血中NE含量也可能會增高，并加劇了對腦組織及其他器官的損害，加重病情。本實驗通過制作大鼠PIVH模型觀察腦干組織藍斑內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元的表達變化及對腦水腫、神經(jīng)行為學評分的影響，進一步探討NE在IVH損傷中的作用，為臨床診斷治療、預測病情提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（300±20）g（由重慶醫(yī)科大學動物科提供），免疫組化觀察藍斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及動物模型建立：實驗動物隨機分為正常組、假手術(shù)組、腦室出血組。參照彭建偉等［1］方法制備PIVH模型。按照Paxinos和Watson［2］《大鼠腦立體定位圖譜》確定右側(cè)側(cè)腦室位于Bregma點后0.8mm，旁開1.5 mm，立體定向儀定位后用骨鉆鉆一直徑約1mm小孔，深達硬腦膜表面即可。用微量進樣器從左側(cè)股動脈抽取40μL動脈血，25℃恒溫水浴箱1～3min使血液稍黏稠，然后固定進樣器在立體定位儀上，沿鉆孔緩慢進針4.5mm（此處為側(cè)腦室位置）以10μL／min速度將血注入腦室內(nèi)，留針10min，然后緩慢退針（30s），縫合頭皮。假手術(shù)組大鼠只切開頭皮和顱骨鉆孔。手術(shù)過程嚴格無菌操作。整個實驗過程保持室溫26℃。術(shù)后不同時間點6h、1d、3d、5d、7d大鼠斷頭處死。

1.2.2 觀察指標：Hua等［3］的觸須誘發(fā)前肢放置試驗法觀察IVH后大鼠的神經(jīng)行為變化，具體如下：檢查者手持大鼠背部皮膚使其四肢懸空，將胡須刷觸桌面角邊緣，測試同側(cè)前肢的活動情況，未受損者可將前肢迅速放到桌面，腦損傷時此動作有不同程度的損害，大鼠每側(cè)受測10次，前肢觸及桌面角邊緣次數(shù)的百分率即為該得分。該方法能夠較敏感反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的感覺與運動功能障礙。（1）腦組織含水量測定：于實驗各相應時間點終止觀察，2%戊巴比妥鈉深度麻醉動物，迅速斷頭，開顱取出腦組織，去除腦膜、低位腦干和小腦，先用電子天平稱濕質(zhì)量，后置于電熱恒溫烤箱，恒溫100℃烘烤24h再稱量獲得干質(zhì)量，按Elliott公式計算腦組織含水量：含水量＝（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）／濕質(zhì)量×100%。（2）腦干藍斑內(nèi)DBH神經(jīng)元DBH陽性細胞計數(shù)：采用多巴胺-β-羥化酶（DBH）免疫組化染色。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用±s表示，各組比較均采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的多個樣本均數(shù)的兩兩比較法（LSD法），變量之間采用相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

見表1～3。分別為各組大鼠不同實時間點籃板內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元細胞熟練、神經(jīng)行為學評分和腦組織含水量的比較結(jié)果?？梢奍VH組藍斑內(nèi)出現(xiàn)大量深染的DBH陽性神經(jīng)元，形態(tài)與正常組、假手術(shù)組相似，染色加深，陽性細胞數(shù)較正常組、假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05）（表1）。神經(jīng)行為學評分6h和1d的評分結(jié)果明顯低于對照組，而注血后3d、5d、7d與2組神經(jīng)行為學評分結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。腦組織含水量IVH組顯著高于正常組、假手術(shù)組（P＜0.05），術(shù)后6h開始升高，1d達高峰，在血腫吸收期（出血后3d）腦組織含水量呈逐漸下降（表3）。

表1 各組大鼠不同時間點LC內(nèi)DBH陽性神經(jīng)元數(shù)量比較 （±s）

表1 各組大鼠不同時間點LC內(nèi)DBH陽性神經(jīng)元數(shù)量比較 （±s）

注：與正常組、假手術(shù)組比較，＊P＜0.05

組別 術(shù)后各時間點6h 1d 3d 5d 7d正常組96±15 97±11 97±7 100±5 95±7假手術(shù)組 99±12 100±12 98±16 97±15 94±6 IVH組 208±9＊247±10 ＊218±22 ＊147±6 ＊121±8 ＊

表2 各組大鼠不同時間點神經(jīng)行為學評分比較 （%，±s）

表2 各組大鼠不同時間點神經(jīng)行為學評分比較 （%，±s）

注：與正常組、假手術(shù)組比較，＊P＜0.05

組別 術(shù)后各時間點6h 1d 3d 5d 7d正常組 87.00±2.5 88.25±2.76 86.25±1.7 88.25±4.4 87.5±4.0假手術(shù)組 86.5±4.6 87.75±3.6 87.00±2.2 88.25±4.3 87.5±4.2 IVH組 76.00±4.5＊66.00 ±2.5 ＊83.5 ±2.6 84.5±4.5 84.7±4.1

表3 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較 （%，±s）

表3 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較 （%，±s）

注：與正常組、假手術(shù)組比較，＊P＜0.05

組別 術(shù)后各時間點6h 1d 3d 5d 7d正常組 74.75±0.18 74.75±0.09 73±3.1 73.75±1.7 74.2 5±1.7假手術(shù)組75.25±0.95 74.25±0.96 73.75±2.61 74.5±0.13 74.25±1.8 IVH組 78.75±0.95＊ 83±0.85＊ 81.5±0.910＊ 77.5±1.3＊ 76.75±0.9＊

3 討論

藍斑（LC）位于三叉神經(jīng)中腦核內(nèi)側(cè)、第四腦室底與側(cè)壁交界處室底灰質(zhì)的腹外側(cè)區(qū)，整個核團從面神經(jīng)核平面一直延伸至中腦下丘平面尾側(cè)［4］。文獻［5］報道，由于LC獨特的色素沉著，很早就被人們在腦干內(nèi)發(fā)現(xiàn)，但對其功能一直缺乏了解，直到用甲醛誘發(fā)熒光法發(fā)現(xiàn)LC含有兒茶酚胺（幾乎全部是NE），人們才認識到LC在機體的重要作用，是神經(jīng)系統(tǒng)NE的最重要來源，同時50%的去甲腎上腺素能神經(jīng)元分布在藍斑。NE以血液中酪氨酸為原料，在胞漿內(nèi)首先羥化成多巴，再脫羧生成多巴胺（DA），然后DA進入囊泡，在囊泡內(nèi)經(jīng)多巴胺-β-羥化酶（DBH）催化生成NE。DBH是合成NE的關(guān)鍵酶，DBH免疫反應陽性不僅可以確定NE能神經(jīng)元的性質(zhì)、分布，而且一定程度上可根據(jù)免疫陽性產(chǎn)物量的多少及染色深淺確定去甲腎上腺素能神經(jīng)元內(nèi)DBH水平、NE含量及變化。因此，DBH是識別去甲腎上腺素能神經(jīng)元的標志酶。

多種病理情況下，均會引起體內(nèi)NE含量的改變，參與疾病的病理生理過程。IVH時，極易阻塞腦室系統(tǒng)引發(fā)顱內(nèi)壓增高，尤其第三、四腦室積血鑄形和腦室擴大使得腦干重要結(jié)構(gòu)受壓和破壞，而血腫本身及其分解產(chǎn)物也對腦干、下丘腦有直接損害作用，藍斑在上述情況下易受到損傷和刺激，去甲腎上腺素能神經(jīng)元可被激活。激活的去甲腎上腺素能神經(jīng)元廣泛的纖維上傳至杏仁體、邊緣皮質(zhì)、新皮質(zhì)致NE釋放，引起相應的反應；下傳到脊髓側(cè)角，調(diào)節(jié)交感神經(jīng)及腎上腺髓質(zhì)興奮，進而引起血漿中去甲腎上腺素濃度迅速上升，參與調(diào)控機體對應激的急性反應。本實驗中腦室出血后，腦干組織內(nèi)NE含量急劇升高，加之腦室出血后藍斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，合成和釋放大量NE，由于腦脊液循環(huán)受阻，腦脊液屏障（BBB）開放，血中NE可直接進入腦內(nèi)，導致腦組織NE含量增加。

大量NE聚集在腦組織周圍，造成腦組織損傷的原因可能有：（1）激動α1受體-磷脂酶C系統(tǒng)或激動α2受體-腺苷酸環(huán)化酶抑制系統(tǒng)升高胞漿Ca2＋濃度，促進神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2＋庫釋放增多，磷脂酶A2活化，花生四烯酸代謝后的物質(zhì)可導致血管收縮，血小板凝集和血管通透性增加，進一步加重腦水腫［6］；（2）促進興奮性氨基酸（EAA）的釋放，增加N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）受體的敏感性，其結(jié)局是引起細胞外Ca2＋大量內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2＋超載，過度激活酯酶、激酶和內(nèi)切酶，進而破壞細胞膜，神經(jīng)纖維，造成神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)破壞；（3）通過激活神經(jīng)元膜上的α1、β腎上腺素受體增加糖利用，提高組織代謝，使腦組織血流和代謝需求不相適應，加重組織乳酸酸中毒［7］；（4）NE可導致神經(jīng)細胞過度興奮，加速能量消耗，使維持腦代謝活動的多種酶如Na＋-K＋-ATP酶活性降低，促使神經(jīng)細胞內(nèi)外離子分布異常，細胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變，激活位于胞膜上的水通道蛋白（AQP），進而促進水和電解質(zhì)通過AQP4進入胞內(nèi)導致細胞水腫［6］，從而引起和加劇腦細胞繼發(fā)性損害；（5）NE作用于腦內(nèi)血管壁上α、β受體，使腦血管痙攣，加重腦缺血和水腫壞死；（6）大量NE使腦血管內(nèi)皮細胞受到損傷，BBB開放，加劇腦水腫［8］；（7）血漿NE升高可直接作用于心血管系統(tǒng)，導致心臟泵血功能下降和外周血管收縮，從而導致腦灌注流量下降［8］，進一步加劇腦組織缺血缺氧；（8）NE有刺激腦細胞分泌腦鈉（BNP）的作用，導致低鈉血癥［9］，這可能與腦組織含水量顯著增加有關(guān)。因此，腦室出血后，更易損傷和刺激下丘腦、腦干組織，引起神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡功能紊亂，打破體內(nèi)內(nèi)環(huán)境平衡，導致一系列激素、神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)生病理性改變，對腦組織本身產(chǎn)生損害，同時也影響全身多器官的功能，誘發(fā)和加重多器官功能障礙綜合征（MODS），加重病情。

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