β-七葉皂甙鈉對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用

楊志勇 萬海濤 程賢亮

1）上海市同濟大學醫(yī)學院 上海 200333 2）上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院神經外科 上海 200333

七葉皂甙鈉（商品名：麥通納）是從七葉樹科植物天師栗干燥成熟果實挲羅子，采用先進工藝提取的一種含多酯鍵三萜皂，有α和β2種異構體。2種異構體理化性質有較大差別，其中β-七葉皂甙鈉是主要的活性異構體［1］。七葉皂甙鈉具有類皮質激素樣抗炎、抗?jié)B出、抗腫脹，增強血管張力、改善微循環(huán)及抗氧化、清除自由基等作用。目前，β-七葉皂甙鈉已經用于臨床多種疾病的治療，而且取得一定療效［2］。本實驗在大鼠腦缺血-再灌注模型中研究β-七葉皂甙鈉的神經保護作用及其潛在機制，以便為臨床β-七葉皂甙鈉治療神經系統(tǒng)疾病提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量（300±20）g，由第二軍醫(yī)大學實驗物中心提供。

1.1.2 主要試劑：多聚賴氨酸（北京中山：生物技術有限公司），0.01mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.40），0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.40），10%水合氯醛、乙醚。β-七葉皂甙鈉針劑（5mg／安瓶）由山東綠葉制藥有限公司生產，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成50mg／30mL，以備用。氯化2，3，5-三苯四氮唑（TTC）購于上海生化試劑公司，用0.1mol／L PBS配制成2%TTC磷酸緩沖液，避光備用。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：所有大鼠予以標準飼料喂養(yǎng)74只大鼠隨機分為假手術組（n＝18）、缺血-再灌注（IR）組（n＝28）和β-七葉皂甙鈉組（七葉皂甙，n＝28）。再灌注48h時處死檢測腦梗死體積、腦水腫、神經功能評分、NISSL染色、TUNEL染色和caspase-3活性。

1.2.2 大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型的制作：①大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型參照Zador等［3］描述的方法，以動物清醒后左前肢不能完全伸展、爬行時向左側轉圈為模型成功標準。假手術組除尼龍線插入深度＜15mm外，其余過程同IR組。正常對照組不作任何處理。術后2h，治療組予以腹腔注射β-七葉皂甙鈉（5.0mg／kg），另2組給予腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)用藥（1次／d）［4］。

1.2.3 腦梗死體積檢測：分別于再灌注后48h，動物采用10%水合氯醛深麻醉，快速開胸暴露心臟，經升主動脈快速灌注37℃肝素化生理鹽水250mL以去除血液，斷頭取腦，將腦放入-20℃冰箱冷凍3min，從前向后連續(xù)冠狀切片，片厚2mm。將腦片小心放入2%TTC磷酸緩沖液中，37℃孵箱內避光孵育20min，數碼相機拍照。經TTC染色后，正常腦組織被染成粉紅色，梗死區(qū)呈蒼白色，界線分明。利用圖像分析軟件Scion Image檢測梗死面積。

1.2.4 腦組織取材和組織切片制備：于再灌注后48h將大鼠腹腔麻醉后經心臟進行灌注固定（各時間點n＝5），并斷頭取腦。從視交叉吻合端至尾端冠狀連續(xù)切片，片厚3mm。切片常規(guī)梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，進行切片，片厚5μm，分別進行NISSL染色和細胞凋亡染色。

1.2.5 腦含水量測定：再灌注后48h處死大鼠，取出大腦半球，沿腦橋上界水平切斷，然后沿中線切開，分離兩側大腦半球，用濾紙將腦組織表面的液體吸干后，立即在電子分析天平上稱取濕質量，然后放入80℃烤箱中烘烤3d，直至質量不再變化，稱取干質量。按以下公式計算大腦半球含水量，腦含水量＝（濕質量-干質量）／濕質量×100%。

1.2.6 凋亡酶檢測：按照廠家說明書要求檢測caspase-3活性。

1.2.7 神經行為學檢測：模型制作后72h，按Longa法5分制標準評分：0分：無神經功能缺損癥狀；1分：對側前肢屈曲；2分：向對側旋轉；3分：向對側傾倒；4分：不能行走或昏迷［5］。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，各組數據以（±s）表示，組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-七葉皂甙鈉對腦梗死體積的影響 假手術組未觀察到明顯梗死（n＝3）。缺血-再灌注后（n＝7），腦梗死體積為（35±6）%。而給予β-七葉皂甙鈉治療后（n＝7），大鼠腦梗死體積顯著下降（17±8）%（vs I／R組，P＜0.05）。見圖1。

圖1 TTC染色

2.2 β-七葉皂甙鈉對腦水腫的影響 結果顯示，假手術組（n＝5）、I／R組（n＝5）和七葉皂甙鈉組（n＝5）的腦含水量分別為（76.14±0.31）%、（82.45±0.54）%和（79.28±0.37）%。I／R組的腦含水量較正常對照和假手術組顯著增加，而七葉皂甙鈉治療后的腦含水量顯著下降（vs I／R組，P＜0.05）。見圖2。

圖2 腦含水量檢測

2.3 β-七葉皂甙鈉對神經功能的影響 結果顯示，假手術組（n＝5）、I／R組（n＝8）和七葉皂甙鈉組（n＝8）的神經功能評分分別為0、2.6±0.45和1.3±0.36。I／R組大鼠神經功能明顯受損，而七葉皂甙鈉治療后能顯著改善再灌注后的神經功能（見圖3）。

圖3 神經功能評分

2.4 β-七葉皂甙鈉對腦神經細胞的影響 NISSL染色顯示，I／R組出現諸多神經元丟失和死亡細胞。在假手術組和治療組，海馬CA1區(qū)的細胞輪廓比較明顯，細胞結構緊湊，細胞較大，富含胞漿和NISSL小體。I／R組細胞分布分散，細胞輪廓不清晰。圖4顯示對NISSL染色進行細胞計數（皮層和海馬），結果顯示，I／R組的存活細胞數顯著低于其他2組。

圖4 NISSL染色及神經元計數

2.5 β-七葉皂甙鈉對神經細胞凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，TUNEL陽性顆粒主要位于神經元細胞核內。I／R組損傷細胞主要表現為圓形、皺縮，突出消失或減少，細胞體變圓，細胞核TUNEL染色陽性。但假手術組和治療組很少見TUNEL陽性細胞。圖5為TUNEL陽性細胞計數（皮層和海馬），與假手術組相比，I／R組皮層和海馬的TUNEL陽性細胞顯著增加，而β-七葉皂甙鈉治療能顯著降低TUNEL陽性細胞數。

圖5 TUNEL染色及凋亡神經元計數

2.6 β-七葉皂甙鈉對caspase-3活性的影響 圖6為缺血-再灌注損傷后48h檢測皮層和海馬的caspase-3活性。結果顯示，I／R組海馬和皮層的caspase-3活性分別為1.27±0.23和1.54±0.25，顯著高于對照組。治療組海馬和皮層caspase-3活性（分別為0.34±0.14、0.44±0.13）顯著低于I／R組。

圖6 皮層和海馬caspase-3活性

3 討論

隨著生活水平的提高，腦卒中發(fā)病率也呈上升趨勢。目前，對于腦卒中的發(fā)病機制進行深入研究，但尚未找到特別有效的腦卒中風治療藥物或手段。七葉皂甙鈉是由中藥娑羅子干燥果實中提取的三萜皂甙鈉鹽，含多酯鍵三萜皂甙，有抗?jié)B出、消腫脹、擴張動脈，增加靜脈張力，改善微循環(huán)和穩(wěn)定血管內皮細胞及消除自由基的作用［6］。目前，七葉皂甙鈉已經用于臨床多種疾病的治療。本實驗對七葉皂甙鈉治療腦缺血-再灌注損傷的療效及其機制進行研究。結果顯示，缺血前及再灌注后采用七葉皂甙鈉治療能有效降低腦梗死體積。此外，治療后的大鼠表現為腦水腫減輕、神經功能改善，可能與治療能增加存活神經元數和抑制神經元凋亡（凋亡酶活性）有關。

七葉皂甙鈉的神經保護作用，可能與下列機制有關：（1）抗炎作用：七葉皂甙鈉具有抗蛋白腫脹作用，可使血漿中促腎上腺皮質激素和可的松水平明顯升高；（2）抗?jié)B出作用：七葉皂甙鈉對致炎物質引起的血管通透性增加有抑制作用，可能與機體靜脈組織中前列腺素2α的分泌增加有關；（3）利尿作用：七葉皂甙鈉的利尿作用主要是一種類皮質激素樣的抗?jié)B出、消腫脹作用，只有在大劑量時才出現；（4）抗氧化、清除自由基：七葉皂甙鈉可以有效清除血液中的自由基，特別是對毒性很強的羥自由基有明顯清除作用，抑制酶性非酯性引發(fā)的脂質過氧化，減輕氧自由基對組織的毒害作用［7］；（5）抗凋亡作用：七葉皂甙鈉可以抑制凋亡酶的活化，減少凋亡細胞［8］。

本研究從抗凋亡的角度對七葉皂甙鈉的神經保護作用進行檢測?；谄呷~皂甙鈉的多效性，其機制應不僅限于對凋亡的影響，其他機制也可能同時參與其神經保護作用。有待更多的研究證實。

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［3］Zador Z，Stiver S，Wang V，et al.Role of aquaporin-4in cerebral edema and stroke［J］.Handb Exp Pharmacol，2009，190（2）：159-170.

［4］李啟明，沙杜鵑，李瑾，等.腹腔注射β-七葉皂甙鈉對缺血-再灌注小鼠腦IL-1／3.AQP4表達的影響［J］.江蘇醫(yī)藥，2011，37（4）：384-387.

［5］鹿寒冰，李曉賓，董瑞國，等.β-七葉皂甙鈉對大鼠缺血性腦水腫及水通道蛋白4表達的影響［J］.中國腦血管病雜志，2009，6（6）：298-303.

［6］朱文俠，王航輝，韓振奎.β-七葉皂甙鈉對腸缺血再灌注損傷后腸粘膜屏障功能、形態(tài)學變化的影響［J］.陜西醫(yī)學雜志，2012，41（12）：1 579-1 581；1 593.

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［8］劉梅，李小剛，譚華.β-七葉皂甙鈉對腦缺血-再灌注損傷大鼠自由基的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2011，14（17）：4-8.