荷葉黃酮的提取和純化工藝研究

蔡敏　李長(zhǎng)春　畢宏光　唐正宇　方翔

摘要：研究孝感本地生長(zhǎng)的荷葉，通過(guò)超聲波輔助乙醇提取法，獲得荷葉黃酮的粗提物，再采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3種不同大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，通過(guò)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)對(duì)3種樹(shù)脂的純化工藝進(jìn)行選擇。結(jié)果表明，在pH 6.5，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min的恒溫振蕩器中，HPD-450的吸附量為95 mg/g、吸附率為39.38%、解吸率為50%，HPD-600的吸附量為98 mg/g、吸附率為40.66%、解吸率為70%，HPD-826的吸附量為112 mg/g、吸附率為46.89%、解吸率為56%。綜合考慮HPD-826型大孔樹(shù)脂對(duì)荷葉黃酮純化效果最佳，適用于精制荷葉黃酮。

關(guān)鍵詞：荷葉；黃酮；大孔樹(shù)脂；純化

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.32；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）22-5691-03

Abstract： The lotus leaf of Xiaogan local growth was studied. The total lotus leaf flavonoids were obtained by ethanol ultrasonic assisted extraction. Three different macro porous absorption resin of HPD-450， HPD-600 and HPD-826 were used to separate and purify the flavonoids. Three kinds of resin purification process were optimized by static adsorption-desorption experiment. The result showed that the adsorption quantity of three kinds of resin were 95 mg/g， 98 mg/g， 112 mg/g， the adsorption rate were 39.38%， 40.66%， 46.89% and the desorption rate were 50%， 70%， 56% for HPD-600， HPD-450 and HPD-826 respectively under the conditions of pH 6.5， temperature 30 ℃， thermostatic oscillator in the speed of 180 r/min. The effects of temperature and the pH on dynamic adsorption were discussed. Therefore， macroporous resin of HPD-826 was suitable to refine lotus leaf flavonoids.

Key words： lotus leaf； flavonoids； macroporous absorption resin； extraction and purification

荷葉為睡蓮科（Nymphaeaceae）水生植物，資源豐富，主要分布在湖北、湖南、安徽、江西、福建、江蘇、山東等省份。荷葉的化學(xué)成分十分復(fù)雜，至今已從荷葉中分離出生物堿、黃酮類(lèi)化合物等多種主要化學(xué)成分[1，2]。研究表明，荷葉中含有以槲皮素為主要成分的黃酮類(lèi)物質(zhì)，且含量豐富[3]。張贇彬等[4]從荷葉中分離出山萘酚和槲皮素-3-丙酯。Elegami等[5]從荷葉中分離出了Myricetin-3-（6-p-coumaroyl）-glucoside，Nympholide A和Nympholide B等黃酮類(lèi)物質(zhì)。延璽等[6]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物具有多種生理功能和抵抗疾病的作用。

通過(guò)研究孝感本地生長(zhǎng)的荷葉，在試驗(yàn)室條件下對(duì)荷葉黃酮類(lèi)粗提物提取工藝研究的基礎(chǔ)上，使用大孔吸附樹(shù)脂HPD-450、HPD-600、HPD-826對(duì)荷葉黃酮類(lèi)粗提物的分離純化效果優(yōu)化，采用靜態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)和動(dòng)態(tài)吸附—解吸試驗(yàn)相結(jié)合的研究方法，獲得靜態(tài)吸附曲線(xiàn)、吸附率和解吸率，通過(guò)比較3種樹(shù)脂的各種參數(shù)，選出適當(dāng)?shù)臉?shù)脂對(duì)荷葉黃酮進(jìn)行分離純化[7，8]。并且在此基礎(chǔ)上探討了pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、恒溫振蕩器的溫度、轉(zhuǎn)速對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附率和解吸率的影響[9，10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮荷葉分別于7月、8月和9月采集于孝感后湖公園中本土生長(zhǎng)的荷葉品種。將采集的荷葉用電熱鼓風(fēng)干燥箱在70 ℃下烘8 h，中草藥粉碎機(jī)粉碎，用60目篩子重復(fù)篩選3次得到荷葉粉末，裝袋密封，放置冰箱內(nèi)，備用[11]。

1.2 試劑與設(shè)備

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（貴州迪大科技有限公司）；大孔吸附樹(shù)脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；無(wú)水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 均為分析純。

設(shè)備：中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；DL-480B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代利離心機(jī)有限公司）；SHZ-III型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；ZHWY-211B型恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；FE20型pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；TBD-2000型中壓層析制備系統(tǒng)（SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO.，LTD.）；Φ5.0×40型層析柱（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定 稱(chēng)取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用30%乙醇標(biāo)定在50 mL容量瓶中，配成濃度為0.200 mg/mL的蘆丁溶液，再分別取0、1、2、3、4、5 mL于25 mL的容量瓶中，在每個(gè)容量瓶中加入1 mL 5%的NaNO2振蕩6 min后加入l mL 5% Al（NO3）3，振蕩5 min，再加入10 mL 10%的NaOH，定容到刻度線(xiàn)，以空白試劑為參比液，于510 nm處測(cè)其吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以影響荷葉黃酮提取率的乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比（g∶mL，下同）、提取時(shí)間和提取溫度為4個(gè)影響因素，取各自的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.3 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附試驗(yàn) 主要采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3種樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)，3種樹(shù)脂均為白色不透明球狀顆粒，它們的性能指標(biāo)見(jiàn)表2。用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取已經(jīng)預(yù)處理好的3種樹(shù)脂各1 g，分別放入3個(gè)干凈的150 mL的具塞錐形瓶，取荷葉黃酮提取液70 mL于燒杯，再準(zhǔn)確量取60%乙醇140 mL加入燒杯，在每個(gè)150 mL的錐形瓶中加入稀釋后的提取液40 mL（測(cè)得pH為6.5），在不改變提取液pH的條件下，放入恒溫振蕩器中（30 ℃，180 r/min）靜態(tài)吸附，然后每間隔1 h測(cè)定錐形瓶上清液中黃酮的濃度。方法如下：分別用3個(gè)移液管，在每個(gè)移液管貼上標(biāo)簽，準(zhǔn)確量取錐形瓶上清液1 mL于3個(gè)25 mL的小燒杯，測(cè)定方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定得到其吸光度，帶入回歸方程公式即可得到錐形瓶中上清液黃酮的濃度。

按照下列算式計(jì)算出各種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量（mg/g）：

上式中，Q是靜態(tài)吸附量（mg/g）；C是初始濃度（mg/mL）；Cv是剩余濃度（mg/mL）；V是溶液體積（mL）；W是樹(shù)脂質(zhì)量（g）。

假設(shè)吸附前與后提取液體積無(wú)變化，可按下列算式計(jì)算出樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率：

1.3.4 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)解吸試驗(yàn) 待靜態(tài)吸附達(dá)到平衡狀態(tài)后，取出上述吸附飽和的3種大孔樹(shù)脂過(guò)濾，濾紙吸收樹(shù)脂表面的殘留溶液，然后放回錐形瓶，加入60%乙醇50 mL，置于恒溫振蕩器中（30 ℃，180 r/min）靜態(tài)解吸，每隔1 h收集一次上清液測(cè)定黃酮的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉黃酮提取工藝結(jié)果

正交試驗(yàn)優(yōu)化荷葉黃酮試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，荷葉中黃酮提取的最佳試驗(yàn)條件為B1A2C1D3，即料液比l∶20，60%乙醇，60 ℃，提取4 h。按照上述獲得的荷葉黃酮提取條件，將7、8、9月采集于孝感后湖公園本土生長(zhǎng)的荷葉樣品分別進(jìn)行浸提，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，吸光度代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程可得，7、8、9月荷葉樣品黃酮含量分別為7.84、7.92、7.87 mg/g，平均含量為7.88 mg/g，此時(shí)黃酮得率為0.788%。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附結(jié)果

3種大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附在每個(gè)時(shí)間段的靜態(tài)吸附量見(jiàn)表4。運(yùn)用Excel軟件繪制出3種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。由表4和圖2可知，HPD-826型大孔吸附樹(shù)脂在6 h左右吸附量就可以達(dá)到最大值112 mg/g，而HPD-450和HPD-600需在8 h左右達(dá)到飽和吸附量，分別為95、98 mg/g。在相同分離純化條件下HPD-826型大孔吸附樹(shù)脂達(dá)到平衡的時(shí)間相對(duì)短，吸附量較大，吸附率較高。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)解吸結(jié)果

恒溫振蕩器中30 ℃，180 r/min靜態(tài)解吸，每隔1 h收集一次上清液測(cè)定黃酮的濃度，3種大孔樹(shù)脂在每個(gè)時(shí)間段的靜態(tài)解吸率見(jiàn)表5。運(yùn)用Excel軟件繪出3種樹(shù)脂的靜態(tài)解吸率曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。由表5和圖3可知，3種樹(shù)脂的解吸平衡時(shí)間都在6 h左右，HPD-450、HPD-600和HPD-826型大孔吸附樹(shù)脂的解吸率分別是50%、70%和56%。

3 小結(jié)與討論

本研究首先通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定超聲波輔助乙醇提取的最佳試驗(yàn)條件為料液比l∶20，60%乙醇，溫度60 ℃，提取4 h。將處于生長(zhǎng)期的荷葉樣品分別進(jìn)行浸提，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，7、8、9月荷葉樣品黃酮含量分別為7.84、7.92、7.87 mg/g，平均含量為7.88 mg/g，此時(shí)黃酮得率為0.788%。

采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，分析吸附量、吸附率和解吸率，結(jié)果表明，3種大孔吸附樹(shù)脂的吸附量和吸附率HPD-826>HPD-600>HPD-450，解吸率HPD-600>HPD-826>HPD-450。綜合3種大孔吸附樹(shù)脂的性能指標(biāo)，HPD-826的吸附量最高，吸附平衡時(shí)間最短，而且解吸率適中，因此選取HPD-826型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)荷葉黃酮純化精制。

對(duì)HPD-826型大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，上清液的pH和溫度變化會(huì)影響荷葉黃酮與樹(shù)脂之間的吸附和解吸能力，大孔樹(shù)脂的吸附性隨著pH的增加先變大后減小，隨著溫度的增加變大。

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（責(zé)任編輯 龍小玲）