石仙桃總黃酮提取物對小鼠抗缺氧作用的研究

劉建新　李燕　凌紅　鄭禮肖　湯宣新

摘要：將小鼠分成試驗組和對照組，試驗組小鼠通過腹腔注射分別給予不同劑量（20、40 mg/kg）的石仙桃總黃酮提取物，對照組腹腔注射生理鹽水（0.1 mL/10g），各組小鼠分別進行常壓密閉缺氧試驗、亞硝酸鈉引起的缺氧試驗和負重游泳試驗。結(jié)果表明，與對照組相比，不同劑量的石仙桃總黃酮提取物均顯著延長了試驗小鼠的常壓密閉缺氧存活時間、亞硝酸鈉引起的缺氧存活時間和負重游泳存活時間（P<0.05）。說明石仙桃總黃酮提取物對小鼠有明顯的抗疲勞、抗缺氧作用。

關(guān)鍵詞：石仙桃；總黃酮提取物；抗疲勞；抗缺氧

中圖分類號：S285.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5668-03

Abstract：To study the fatigue-resisting and anoxia-resisting effect of the total flavones extracts from PhoIidota chinensis Iindl.，the mice were randomly individed to test group and control group，each group was injected total flavones extracts with different dots and normal saline and finally taken normobaric hypoxia test，NaNO2-induced hypoxia test and loading swimming test.The results showed that the survival time of the mice in test groups during all tests were all significantly prolonged（P<0.05）.It indicated that the total flavones from PhoIidota chinensis Iindl.had obvious anti-fatigue and and anti-hypoxia effects on mice.

Key words：PhoIidota chinensis Lind.；total flavones；anti-fatigue；anti-hypoxia

黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類多酚類化合物，具有良好的抗氧化活性、清除自由基及對心腦血管的保護等作用，并能提高機體抗疲勞和耐缺氧的能力。石仙桃系蘭科石仙桃屬植物石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）的全草，俗稱石上蓮、石橄欖、石穿盤等。始載于《生草藥性備要》。其性甘味涼，具有養(yǎng)陰、清熱、利濕、消瘀的功效[1]。民間常用于清肺、化痰止咳和抗疲勞等作用。石仙桃屬植物全球約30種，中國有14種，產(chǎn)于南方，尤以西南地區(qū)多見。據(jù)研究表明石仙桃主要化學成分為萜類、酚類、木脂素類、黃酮類，多糖等[2-5]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)石仙桃提取物具有抗缺氧及抗疲勞作用，本試驗旨在研究其總黃酮化合物是否為石仙桃主要活性成分之一，并對其抗缺氧和抗運動性疲勞作用進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物：SPF級昆明種小鼠，體重（20+2） g，雌雄兼有，自由取食，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。實驗動物質(zhì)量合格證：No.43004700005357。

石仙桃總黃酮提取物的制備：總黃酮測定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH分光光度比色法[6]，精確稱取蘆丁對照品2.70 mg，用70%乙醇溶解，用10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL蘆丁對照品溶液，分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞試管中，加水至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻靜置6 min，加10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻靜置6 min，加4%氫氧化鈉3.0 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻靜置15 min。另取一支10 mL具塞試管，不加對照品溶液，只加顯色劑，按照上法制成空白對照液。采用紫外可見分光光度計在510 nm波長處測定其吸光度，繪制標準曲線。精確稱取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，在一定功率、一定時間、一定溫度、一定液料比、一定濃度乙醇的條件下提取，減壓抽濾，回收濾液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待測溶液。取待測溶液5 mL，加入15 mL 70%乙醇，搖勻。取稀釋液2 mL，顯色，制成10 mL顯色液及空白對照液，在510 nm下測定其吸光度，按回歸方程計算出樣品溶液中的總黃酮含量（mg/mL），根據(jù)稀釋倍數(shù)及樣品質(zhì)量計算出樣品中總黃酮的含量（mg/g）。然后通過石仙桃總黃酮的微波輔助提取法正交試驗設計，在最佳工藝條件即微波功率300 W、提取時間 30 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶20（g/mL）、80%乙醇條件下，測定其吸光度，計算得石仙桃提取物中總黃酮含量為31.41 mg/g。制備4 mg/mL石仙桃總黃酮提取物，供試驗時使用。

1.2 儀器

WF-4000C型常壓微波快速反應系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；Lambda35型紫外可見分光光度計（美國鉑金埃爾默公司）；DZF-6050型烘箱（上海一恒科技有限公司）；EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）。

1.3 方法

1.3.1 石仙桃總黃酮提取物對小鼠常壓耐缺氧的影響 將小鼠隨機均分為3組，每組10只，分別腹腔注射給予不同劑量的石仙桃總黃酮提取物（20、40 mg/kg）和生理鹽水（0.1 mL/10 g）。給藥20 min后，將小鼠放置在密封的250 mL含鈉石灰的廣口瓶中（瓶內(nèi)放鈉石灰10 g，每瓶放小鼠1只），瓶口涂凡士林密閉。觀察小鼠至最后一次呼吸為止，用秒表記錄時間，即為小鼠的存活時間。

1.3.2 石仙桃總黃酮提取物對亞硝酸鈉引起的小鼠缺氧的影響 將小鼠隨機均分為3組，每組10只，分別腹腔注射給予不同劑量的石仙桃總黃酮提取物（20、40 mg/kg）和生理鹽水（0.1 mL/10g）。給藥40 min后，分別按200 mg/kg的劑量腹腔注射給予亞硝酸鈉，觀察小鼠至最后一次呼吸為止，用秒表記錄時間，即為小鼠的存活時間。

1.3.2 石仙桃總黃酮提取物對小鼠負重游泳存活時間的影響 將小鼠隨機均分為3組，每組10只，分別腹腔注射不同劑量的石仙桃總黃酮提取物（20、40 mg/kg）和生理鹽水（0.1 mL/10g）。給藥40 min后，在小鼠尾根部負其體重3%的鉛絲，置于水溫30 ℃、水深35 cm、直徑40 cm、桶高為50 cm的水桶中，每只水桶放入1只小鼠。用秒表記錄小鼠自游泳開始至力竭下沉且8 s不能浮出水面的時間作為其游泳至力竭的時間。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 11.50統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石仙桃總黃酮提取物對小鼠常壓耐缺氧的影響

由表1可見，石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組小鼠常壓耐缺氧時間均比生理鹽水對照組長，且與生理鹽水對照組相比差異均達顯著水平（P<0.05）；石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組間差異也達顯著水平（P<0.05）。提示石仙桃總黃酮提取物呈劑量依賴性地提高了小鼠的耐缺氧能力。

2.2 石仙桃總黃酮提取物對亞硝酸鈉引起的小鼠缺氧的影響

由表2可見，石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組小鼠耐組織性缺氧生存時間均比生理鹽水對照組延長，且與生理鹽水對照組相比差異均達顯著水平（P<0.05）；石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組間差異也達顯著水平（P<0.05）。表明石仙桃總黃酮提取物呈劑量依賴性地延長了亞硝酸鈉所致組織性缺氧小鼠的存活時間。

2.3 石仙桃總黃酮提取物對小鼠負重游泳存活時間的影響

由表3可見，石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組小鼠負重游泳存活時間均比生理鹽水對照組延長，且與生理鹽水對照組相比差異均達顯著水平（P<0.05）；石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組間差異也達顯著水平（P<0.05）。表明石仙桃總黃酮提取物呈劑量依賴性地延長了小鼠負重游泳存活時間。

3 小結(jié)與討論

在缺氧代償期，由于酸性代謝產(chǎn)物如乳酸和二氧化碳的蓄積，反射性地引起呼吸加深加快，心跳加強加快，增加心搏出量以及血液重新分配，最大程度地保證心臟和大腦等重要器官的最高血氧飽和度及血液供應。到缺氧晚期，持續(xù)的嚴重缺氧造成供氧不足而發(fā)生不可逆的機能障礙和損傷，甚至發(fā)生組織壞死和機體死亡。本試驗結(jié)果表明，石仙桃總黃酮提取物能明顯延長小鼠缺氧條件下存活時間，增強小鼠的應激反應能力，對機體重要器官心、腦在缺氧條件下的損傷起到了一定的保護作用。亞硝酸鈉對機體的缺氧損害機制主要是使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，從而造成血紅蛋白失去運輸氧的能力，引起組織缺氧性損害。通過這兩種耐缺氧試驗，顯示石仙桃總黃酮提取物不僅能提高供氧不足環(huán)境下的小鼠的生存能力，也能提高組織性缺氧環(huán)境下的小鼠的存活能力，表明石仙桃總黃酮提取物可提高機體對不同條件下的缺氧適應能力和生存能力。石仙桃總黃酮提取物能明顯延長小鼠游泳存活時間，提高有氧條件下的運動能力，增加心肌工作能力的儲備，具有有效提高運動能力和抵抗疲勞的作用。

綜上所述，中藥石仙桃不僅含有豐富的黃酮組分，而且石仙桃的黃酮組分是其抗疲勞和耐缺氧的重要活性成分之一。藥材標準含量測定項目應以功能主治一致的有效成分為測定指標，因此本研究可為該藥材標準的制定提供依據(jù)，也為進一步開發(fā)該藥材的應用提供了理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 易緒斐，邢福武，陳紅鋒，等.我國石仙桃屬植物的分布和開發(fā)利用[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2004，25（3）：94-97.

[2] 馬雪梅，李滿飛，張慶榮.云南石仙桃化學成分的研究[J].中草藥，1995，26（2）：59-62.

[3] 馬雪梅，章 萍，于蘇萍，等.云南石仙桃及石斛總生物堿和多糖含量的分析[J].中草藥，1997，28（9）：561-563.

[4] 畢志明，王崢濤，徐珞珊，等.云南石仙桃中酚類成分的研究[J].中國中藥雜志，2004，29（1）：47-49.

[5] 沈維治，鄒宇曉，林光月，等.瑪咖抗疲勞作用及活性組分研究[J].食品與生物技術(shù)學報，2014，33（7）：721-725.

（責任編輯 曾德芳）