酶解法催化鵝油制備甘油二酯

王寶維 韓海娜 葛文華 張名愛岳 斌 陳 晨 徐曉波 解 超

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所1，青島 266109）（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，青島 266109）

酶解法催化鵝油制備甘油二酯

王寶維1，2韓海娜2葛文華1張名愛2岳 斌1陳 晨2徐曉波2解 超2

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所1，青島 266109）（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，青島 266109）

為提高鵝油的附加值，開發(fā)天然食品添加劑，本試驗以肥肝鵝腹脂精煉后的鵝油為脂肪酸供體制備甘油二酯。以鵝油混合脂肪酸、甘油為原料，甘油二酯的生成率為指標(biāo)，底物比（脂肪酸∶甘油）、加酶量、反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度為因素，采用響應(yīng)面法對鵝油甘油二酯的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度為46℃，反應(yīng)時間為9.2 h，底物比為1.2，加酶量為3.03%時，甘油二酯的生成率為92.57%。

鵝油 脂肪水解 響應(yīng)面 甘油二酯

甘油二酯是一類三酰甘油中一個脂肪酸被羥基取代的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，是天然植物油脂的微量成分及體內(nèi)脂肪代謝的內(nèi)源中間產(chǎn)物［1］，它是FDA公認(rèn)安全（GRAS認(rèn)證）的食品成分［2］。目前，甘油二酯作為多功能添加劑，不僅與普通食用油在口感、外觀等方面有相似的性狀［3－4］，而且具有減少體內(nèi)脂肪堆積，預(yù)防高血脂等相關(guān)疾病的功能［5－6］。就國內(nèi)而言，甘油二酯的生產(chǎn)方法還沒有取得突破性進(jìn)展。目前國內(nèi)甘油二酯尚未見產(chǎn)業(yè)化報道。鵝油具有熔點低、香味獨特，尤其是經(jīng)過填飼的肥肝鵝腹部和皮下等部位沉積大量的脂肪，經(jīng)過精煉處理得到的鵝油，膽固醇含量低、不飽和脂肪酸含量很高，是一種有待于開發(fā)的動物性油脂。但是目前對于鵝油的研究較少，大部分鵝油都用作飼料而造成浪費。因此，以精煉鵝油作為脂肪酸供體制備甘油二酯，可以大大提高鵝油的經(jīng)濟(jì)利用價值，提高產(chǎn)品的附加值。劉艷豐等［7］以亞麻籽油為原料制備富含α－亞麻酸的甘油二酯，結(jié)果表明：反應(yīng)的最佳條件為底物摩爾比（亞麻籽油∶甘油）＝5∶3，加酶量8.8%，反應(yīng)溫度為58.3℃，反應(yīng)時間為9.1 h。在此反應(yīng)條件下反應(yīng)所得產(chǎn)物中甘油二酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)約達(dá)50.21%。Roberta等［8］研究在叔丁醇體系中通過脂肪酶Novozym435甘油解法生成甘油單酯和甘油二酯，結(jié)果表明：單甘酯和甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可分別達(dá)到53%和50%。李鶴等［9］以固定化脂肪酶為催化劑，研究無溶劑體系下甘油和辛酸直接酯化合成甘油二酯工藝，甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到71.9%。目前，甘油二酯的合成方法大都存在反應(yīng)底物粘度大、反應(yīng)速度慢、反應(yīng)不易控制、副產(chǎn)物游離脂肪酸多和分離困難等問題。因此，有必要提供一種更簡便有效的甘油二酯制備方法，以提高鵝油的利用率，實現(xiàn)其更高的價值。本研究以肥肝鵝腹脂精煉后的鵝油為脂肪酸供體，鵝油混合脂肪酸、甘油為原料，以底物比（脂肪酸∶甘油）、加酶量、反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度為因素，以甘油二酯的生成率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對鵝油甘油二酯的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在開發(fā)新型鵝油食品添加劑，為提高水禽加工副產(chǎn)品的附加值提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

肥肝鵝腹脂：山東高密雁王食品有限公司；Novo435：諾維信生物技術(shù)有限公司；甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma；Agilent1100液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鵝油的精煉

1.2.1.1 加熱融化

將肥肝鵝腹脂置于55℃下融化，真空抽濾除去雜質(zhì)，即可制得粗鵝油。

1.2.1.2 脫膠處理

將粗鵝油在水浴中加熱至60℃，并不斷攪拌，然后緩慢加入占鵝油體積1%的磷酸（體積分?jǐn)?shù)為80%），攪拌均勻，在60℃下加熱2 min，再以4 000 r／min離心20 min，上層漂浮的油即為脫膠鵝油。

1.2.1.3 脫色處理

將脫膠鵝油水浴加熱至60℃，加入占鵝油重3%的活性白土，攪拌20 min后，以4 000 r／min離心20 min，上層漂浮的油即為脫色鵝油。

1.2.1.4 脫臭處理

將脫色鵝油置于圓底燒瓶中，置于45℃的溫度下，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空處理鵝油30 min，即得脫臭鵝油。

1.2.2 混合脂肪酸的制備

將精煉處理的鵝油按體積比1∶4的比例加入1 mol／L NaOH－乙醇溶液，磁力攪拌一段時間使其完全溶解后轉(zhuǎn)移至1 000 mL的三口燒瓶，氮氣保護(hù)下水浴回流皂化一段時間，得皂化液；減壓蒸出乙醇，加水使皂化物完全溶解，在恒溫恒速攪拌的條件下用10%HCl酸化至pH 2～3，加入一定體積的正己烷萃取，溫水洗至中性，減壓蒸出溶劑，加無水硫酸鈉脫水，抽濾，得混合脂肪酸。

1.2.3 甘油二酯的制備

按比例稱取一定量的甘油和混合脂肪酸于小燒瓶中，置于恒溫?fù)u床中，使反應(yīng)物混合均勻，待升至所規(guī)定的溫度后加入一定量Novo435，開始計時，恒溫反應(yīng)一段時間后通過離心可將酶分離，即可得到高甘油二酯混合物。

1.2.4 甘油二酯含量的測定

液相色譜法測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗

1.3.1.1 酶解溫度的篩選

設(shè)定底物比為1∶1，加酶量3%，反應(yīng)時間8 h條件下，調(diào)節(jié)酶解溫度為35、40、45、50、55、60、65、70℃分別進(jìn)行試驗，測定甘油二酯生成率，并對其反應(yīng)溫度進(jìn)行初步篩選。

1.3.1.2 酶解時間的篩選

設(shè)定底物比為1∶1，加酶量3%，反應(yīng)溫度50℃條件下，調(diào)節(jié)酶解時間為0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)行試驗，測定甘油二酯生成率，并對其反應(yīng)時間進(jìn)行初步篩選。

1.3.1.3 底物比的篩選

設(shè)定加酶量為3%，反應(yīng)時間8 h，反應(yīng)溫度50℃條件下，調(diào)節(jié)甘油與混合脂肪酸的質(zhì)量比例為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3分別進(jìn)行試驗，測定甘油二酯生成率，并對其底物比進(jìn)行初步篩選。

1.3.1.4 反應(yīng)加酶量的篩選

設(shè)定底物比為1∶1，反應(yīng)時間8 h，反應(yīng)溫度50℃條件下，調(diào)節(jié)加酶量為1%、2%、3%、4%、5%分別進(jìn)行試驗，測定甘油二酯生成率，并對加酶量進(jìn)行初步篩選。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗所得結(jié)果，以底物比、反應(yīng)加酶量、酶解時間、酶解溫度為4個因素，每因素設(shè)計3個水平，并以甘油二酯生成率為指標(biāo)設(shè)計響應(yīng)面試驗，以確定鵝油甘油二酯的最佳制備工藝，試驗設(shè)計的因素水平如表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼

1.3.3 甘油二酯制備最佳工藝條件回歸試驗

在響應(yīng)面試驗得出的最佳工藝條件下進(jìn)行試驗，測定甘油二酯生成率，與響應(yīng)面設(shè)計的試驗結(jié)果相比較，以證明結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶解溫度的篩選

圖1 酶解溫度對反應(yīng)程度的影響

如圖1所示，反應(yīng)溫度為45℃時，底物的反應(yīng)程度最高，因此，分別選取40、45、50℃作為下一步試驗的反應(yīng)溫度。

2.1.2 酶解時間的篩選

如圖2所示，底物的反應(yīng)程度隨反應(yīng)時間的增加，呈先上升后不變的趨勢，當(dāng)反應(yīng)時間為8 h時，反應(yīng)程度最高，因此，分別選取6、8、10 h作為反應(yīng)時間進(jìn)行下一步試驗。

圖2 酶解時間對反應(yīng)程度的影響

2.1.3 底物比的篩選

如圖3所示，底物比例為1∶1時，體系的反應(yīng)程度最高，之后體系的反應(yīng)程度逐漸變低，因此，分別選取鵝油∶甘油＝0.5、1、1.5作為下一步試驗的底物比例。

圖3 底物比例對反應(yīng)程度的影響

2.1.4 反應(yīng)加酶量的篩選

圖4 加酶量對反應(yīng)程度的影響

如圖4所示，隨著酶含量的增加，反應(yīng)程度開始升高，直至恒定，加酶量為3%時，反應(yīng)程度最高。因此，分別選取2%、3%、4%作為下一步試驗的加酶量。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果

根據(jù)Box－Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗所得結(jié)果，以酶解溫度、酶解時間、底物比例、加酶量4個因素作為自變量，分別以A、B、C、D表示，自變量的編碼值1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，反應(yīng)程度（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計試驗方案見表2。

表2 響應(yīng)面方案及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

通過響應(yīng)面軟件Design Expert 7.0對試驗結(jié)果進(jìn)行分析后得出其線性回歸方程如下：

Y＝92．00＋0．95A＋1．22B＋0．31C－0．62D＋1．23AB＋0．82AC－0．64AD＋1．19BC＋0．42BD＋0．82CD－3．58A2－1．17B2－3．84C2－2．17D2

對上述響應(yīng)面試驗進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3。由表3可知，回歸模型整體呈極顯著（P＜0.01），模型失擬項為0.115 4＞0.05，沒有顯著性影響，說明殘差由隨機(jī)誤差造成，且回歸方程可以代替真實點進(jìn)行試驗結(jié)果的分析。模型決定系數(shù)R2＝0.958，表明模型擬合度較好，可以良好的描述此試驗。一次項對試驗影響大小排序為B＞A＞D＞C，即：酶解時間＞酶解溫度＞加酶量＞底物比，其中酶解溫度、酶解時間、加酶量對試驗有顯著性影響（P＜0.05）。交互項中BC和AB顯著性較好，說明酶解時間和底物比，酶解溫度和酶解時間的相互作用對提取率的影響較大。經(jīng)Design Expert 7.0軟件分析后，得出酶法制備鵝油甘油二酯的最佳工藝條件為：酶解溫度為46℃，反應(yīng)時間為9.2 h，底物比（混合脂肪酸∶甘油）為1.12，加酶量為3.03%，在此條件下甘油二酯的生成率為92.57%。

表3 響應(yīng)面方差分析

2.3 鵝油甘油二酯最佳工藝條件回歸試驗

在最佳工藝條件下進(jìn)行5次平行試驗，底物的反應(yīng)程度分別達(dá)到92.3%、92.5%、92.4%、92.3%、92.1%，平均反應(yīng)程度為92.3%，與響應(yīng)面設(shè)計的結(jié)果基本一致，表明本工藝具有很好穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 不同酶解溫度對底物反應(yīng)程度的影響

李磊等［10］以高酸價米糠油為原材料，采用酶法制備富含甘油二酯米糠油，其最佳反應(yīng)溫度為56℃。陳曉慧等［11］利用脂肪酶催化大豆油脂與甘油反應(yīng)制備甘油二酯的過程中，選擇70℃為最佳反應(yīng)溫度。李相等［12］以甘油、油酸為原料，優(yōu)化在無溶劑體系中酶解催化合成甘油二酯的工藝，結(jié)果表明，其最佳反應(yīng)溫度為48.14℃。與上述研究相比較，本試驗的最佳反應(yīng)溫度為46℃，溫度過高會使固定化脂肪酶融化，脂肪酶失活而使反應(yīng)不能正常進(jìn)行；溫度過低會導(dǎo)致酶活降低，酶解反應(yīng)不充分。最佳反應(yīng)溫度的不同，可能與所用脂肪酶、底物種類有關(guān)。

3.2 不同酶解時間對底物反應(yīng)程度的影響

當(dāng)體系反應(yīng)時間不同時，底物的酶解程度也不相同。徐揚等［13］研究表明：用偏甘油酯脂肪酶Lipase G50催化甘油和脂肪酸酯化反應(yīng)合成甘油二酯，最佳反應(yīng)時間為24 h。任運宏等［14］以大豆油為底物制備甘油二酯，結(jié)果表明，最佳反應(yīng)時間為7 h。本試驗最佳酶解時間為9.2 h，與以上反應(yīng)均不相同。這可能與底物比例、加酶量有關(guān)。

3.3 不同底物比例對底物反應(yīng)程度的影響

本試驗研究表明，不同的反應(yīng)底物比例對酶解反應(yīng)程度影響很大，當(dāng)鵝油混合脂肪酸與甘油質(zhì)量比為1.12∶1時，酶解反應(yīng)進(jìn)行的最徹底。邱壽寬等［15］選取大豆油、甘油為底物，最佳比例為2∶1。鐘南京等［16］以脂肪酸、甘油為底物，最佳比例為2.25∶1。由此可見，試驗選取的底物成分，直接影響到其與甘油的最佳比例，以及酶解反應(yīng)的程度。

3.4 不同的加酶量對底物反應(yīng)程度的影響

大量研究顯示［17，19］，在甘油二酯的制備過程中，脂肪酶的添加量對體系的反應(yīng)程度有很大影響。隨著脂肪酶含量的增加，底物的反應(yīng)速度變快，反應(yīng)程度變大，然而當(dāng)脂肪酶達(dá)到一定的百分比后，酶解反應(yīng)進(jìn)行緩慢或不再進(jìn)行，這說明底物在此條件下已經(jīng)基本反應(yīng)完全。本試驗中，最佳加酶量為3.03%，此時酶解反應(yīng)完全，底物得到充分利用。

4 結(jié)論

酶法制備鵝油甘油二酯的最佳工藝條件：酶解溫度為46℃，反應(yīng)時間為9.2 h，底物比（混合脂肪酸∶甘油）為1.12，加酶量為3.03%，在此條件下甘油二酯的生成率達(dá)到92.57%，大大提高了產(chǎn)品得率。

［1］Naito S，Watanabe H，Shimasaki H，et al.Effect of dietary diacylglycerols on lipids metabolism in human：1.The suppressive effectof dietary diacylglycerols on the increase of the serum triglycerides［C］.16 th International Congress of Nutrition，1997，341

［2］FDA.GRAS Notice No.GRN 000056［EB／OL］.http：／／www.Fda.gov／Food／Food Ingredients Packaging／Generally Recognized as Safe GRAS／GRASListings／ucm153749. htm，2000

［3］Tsuneo Y，Sung TK，Katsuyoshi K，etal.High Yield diacylglycerol formation by solid－phase enzymatic glycerolysis of hydrogenated beef tallow［J］.Journal of American Oil Chemists'Society，1994，71（3）：339－342

［4］Morita O，SoniM G.Safety assessmentof diacylglycerol oil as an edible oil：a review of the published literature［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47：9－21

［5］Hiroyuki T，Tomonori N，Hiroyuki W.Energy value and digestibility of dietary oil containingmainly 1，3－diacylglycerol are similar to those of triacylglycerol［J］.Lipids，2001，36（8）：379－382

［6］MengX H，Zou D Y，Shi Z P，et al.Dietary diacylglycerol prevents high－fatdiet－induced lipid accumulation in pat liverand abdominal adipose tissue［J］.Lipids，2004，39（1）：37－41

［7］劉艷豐，黃惠華.酶催化亞麻籽油甘油解制備富含α－亞麻酸的甘油二酯的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（7）：216－219

［8］Roberta L.K，Alexsandra V，Manuela B，et al.Improvement of mono and diacylglycerol production via enzymatic glycerolysis in tert－butanol system［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2010，112（8）：921－927

［9］李鶴，劉云，徐莉，等.甘油二酯的酶法合成工藝研究［J］.應(yīng)用化工，2011，40（1）：8－12

［10］李磊，黃建花，金青哲，等.酶法催化制備富含甘油二酯米糠油的研究［J］.中國油脂，2011，36（7）：36－40

［11］陳曉慧，王雪，劉晶，等.超臨界體系酶催化制備甘油二酯及其純化［J］.食品科學(xué)，2012，33（2）：43－47

［12］李相，劉云，楊江科，等.基于響應(yīng)面設(shè)計脂肪酶Novo435催化合成甘油二酯的工藝優(yōu)化［J］.生物加工過程，2009，7（5）：13－18

［13］徐揚，王衛(wèi)飛，陳華勇，等.偏甘油酯脂肪酶Lipase G50催化酯化法制備甘油二酯［J］.中國油脂，2012，37（2）：46－50

［14］任運宏，孫博，劉晶，等.超臨界體系酶法催化甘油解制備甘油二酯的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（10）：337－340

［15］邱壽寬，畢艷，楊天奎，等.Lipozyme RM IM酶促豆油甘油解制備甘二酯的研究［J］.鄭州工程學(xué)院學(xué)報，2004，25（1）：33－36

［16］鐘南京，董玲燕，李琳，等.酶法酯化脂肪酸與甘油合成1，3－甘油二酯［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，31（2）：59－61

［17］鄭平玉，王衛(wèi)飛，王永華，等.高純度甘油二酯的酶法合成及性質(zhì)研究［J］.中國油脂，2013，38（3）：43－46

［18］劉小如，張超，胡蔣寧，等.酶催化茶油合成甘油二酯工藝及脂肪酸變化［J］.食品科學(xué)，2013，34（2）：36－41

［19］Phuong L V，Rae K P，Yun JL.Two－step production of oil enriched in conjugated linoleic acids and diacylglycerol［J］.Journal of American Oil Chemists Society，2007，84：123－128.

Enzymatic Goose Oil into Diglyceride

Wang Baowei1，2Han Haina2Ge Wenhua1Zhang Ming′ai2Yue Bin1Chen Chen2XuXiaobo2Xie Chao2
（Institute of High Quality Waterfowl，Qingdao Agricultural University1，Qingdao 266109）
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University2，Qingdao 266109）

The experiment has been conducted to improve the added value of goose oil and develop natural food additives.The goose oil produced by foie gras goose has been taken as donator of fatty acid to prepare diglyceride. Goose oil，fatty acids and glycerolweremixed and utilized as raw materials.Generation rate of diglyceridewas indicator，substrate ratio（fatty acid∶glycerol），amount of enzyme，reaction time and temperaturewere factors.The preparation process of goose oil diglyceride was optimized by surfacemethodology.The results showed that the best condition was the reaction temperature 46℃，reaction time 9.2 h，substrate ratio 1.12 and enzyme dosage 3.03%.The generation rate of goose oil diglyceride finally reached to 92.57%.

goose fat，lipolytic，response surface，diglyceride

TQ432.2

A

1003－0174（2015）

山東省2013年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題（6681301），國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項基金（CARS－43－11）

2013－10－31

王寶維，男，1959年出生，教授，營養(yǎng)與保健03－0080－05