白血病發(fā)生發(fā)展過程中的克隆演變

劉黔偉 綜述 魏輝 審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所血液病醫(yī)院白血病診療中心，天津300020

白血病發(fā)生發(fā)展過程中的克隆演變

劉黔偉 綜述 魏輝#審校

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院血液學研究所血液病醫(yī)院白血病診療中心，天津300020

白血病是一組多基因病，其克隆演變過程受到多種因素的調(diào)控。白血病的克隆演變過程是一個順序性、多步驟基因突變的積累過程。白血病優(yōu)勢克隆的產(chǎn)生，正是機體內(nèi)環(huán)境和藥物的選擇性與各種亞克隆自身適應性相博弈的結(jié)果。隨著二代測序技術(shù)的深入發(fā)展，學者們對白血病的克隆演變過程有了更加深入的認識，而且這種認識還在不斷地深化。這必將使白血病的診斷和治療模式發(fā)生翻天覆地的變化。

白血病；克隆演變；基因突變；RNA；耐藥

白血病的克隆演變是一個多步驟的過程；在演變過程中，造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）發(fā)生累積性基因突變，且突變隨時間推移而被不斷積累。在驅(qū)動突變與非驅(qū)動突變的協(xié)調(diào)作用下，白血病不斷地發(fā)展、演變，該過程同時受到非編碼RNA的調(diào)控，以及藥物與內(nèi)環(huán)境的選擇。白血病克隆演變過程與白血病自然病程、復發(fā)及耐藥機制均有密切關(guān)系。

1 基因突變對造血細胞的作用

1.1 基因突變的作用效應

涉及白血病的基因突變數(shù)目較多，不同的基因突變可通過不同的方式產(chǎn)生作用。TET2、DNMT3A、IDH1/2等基因突變可引起DNA甲基化[1]。TET2酶可以使5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5 mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5 hmC）[2]，從而調(diào)節(jié)DNA甲基化與去甲基化的動態(tài)平衡，DNMT3A與IDH1/2分別通過甲基轉(zhuǎn)移酶與異檸檬酸脫氫酶使胞嘧啶甲基化，從而影響DNA復制和腫瘤的發(fā)展演變[3-4]。而ASXL1、EZH2及UTX等基因突變則通過組蛋白修飾發(fā)揮作用，研究[5]表明，在骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者中，ASXL1、EZH2和UTX突變可通過修飾組蛋白導致基因表達的異常調(diào)節(jié)。RUNX1可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)參與到急性髓系白血?。╝cutemyelocytic leukem ia，AML）的演變過程，JAK2可通過信號轉(zhuǎn)導途徑增加造血細胞對細胞因子的敏感性，使血細胞異常增殖[6]。此外，還有多種基因突變通過不同方式直接或者間接地參與白血病的克隆演變進程。

1.2 基因突變累積對造血細胞的影響

白血病的發(fā)生發(fā)展受到多個基因的影響。從正常HSC到白血病前期的基因累積階段，獲得的基因突變主要有兩方面作用：一方面使HSC保持自我更新的能力，另一方面使之發(fā)生分化。當形成白血病克隆后，基因突變的主要作用是導致細胞增殖，形成生存優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，TET2突變、DNMT3A突變等維持HSC自我更新的基因突變傾向于在演變過程的早期出現(xiàn)[7]。而Fms樣酪氨酸激酶3內(nèi)部串聯(lián)重復（Fms-like tyrosine kinase3-intenal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD）突變損傷HSC自我更新能力可能屬于白血病進展期的事件[8]。

在使用酪氨酸激酶抑制劑治療14例慢性髓系白血?。╟hronicmyeloid leukem ia，CML）患者的過程中，出現(xiàn)了Ph陰性的克隆性染色體異常；對這14例患者進行了突變檢測，6例可以檢測到基因突變，突變的基因包括DNMT3A、EZH2、RUNX1、TET2、TP53、U2AF1和ZRSR2，其中2例的基因突變在初診時Ph陽性的克隆中也可以被發(fā)現(xiàn)；對1例初診CML患者的分析發(fā)現(xiàn)，在Ph陰性和Ph陽性克隆中，都存在DNMT3A突變；由于在Ph陰性和Ph陽性細胞中同時存在BCR-ABL以外的基因突變，因此，這一研究提示BCR-ABL以外的基因突變對CML發(fā)生發(fā)展過程中的克隆演變發(fā)揮著重要作用[9]。

2 非編碼RNA與白血病的克隆演變

2.1 非編碼RNA在白血病克隆演變中的作用

2.2 lncRNA與白血病的克隆演變

在對148例未治療的60歲以上細胞遺傳學正常的AML患者的研究中，針對48種lncRNA進行評分，發(fā)現(xiàn)lncRNA評分不理想者的完全緩解率較低（54%vs 89%）,無病生存率與總生存率均較低[11]。已有大量研究證實lncRNA直接或者間接參與白血病的克隆演變過程，lncRNA可通過調(diào)節(jié)分化過程中的基因表達參與白血病的克隆演變，如：HOTAIRM 1（HOX antisense intergenic RNAmyeloid 1）可調(diào)節(jié)原始粒細胞分化所必需的幾個基因的表達，包括編碼造血過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的HOXA1與HOXA4基因。全反式維甲酸誘導分化過程中，正是由于短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）介導的HOTAIRM 1分解，抑制了HOXA1與HOXA4的表達[12]。研究[13]表明，lncRNA-P21與BCR-ABL共同調(diào)節(jié)不均一性核內(nèi)核糖蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleo-protein K protein，hnRNPK）的含量，其可能參與CML細胞的演變過程。lncRNA MEG3可通過激活p53間接參與AML和MDS的演變過程[13-14]。

非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）在白血病克隆演變過程中的調(diào)節(jié)作用逐漸被重視。ncRNA包括短片段非編碼RNA（siRNA、m iRNA、piRNA）和長片段非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。siRNA（small interfering RNA）通常不存在于脊椎動物中，可依賴于質(zhì)粒或病毒間接作用于細胞。而miRNA（m icroRNA）作為基因表達的一種調(diào)控機制，直接參與某些白血病的發(fā)病機制，如miR-15a、m iR-16a與慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic leukem ia，CLL）發(fā)病密切相關(guān)[10]。piRNA（piw i-interacting RNA）具有維持干細胞功能及維持mRNA穩(wěn)定性的作用，可能參與白血病的演變過程，但該方面的已有研究較少。而備受關(guān)注的lncRNA可通過多種途徑參與白血病的克隆演變過程。

3 白血病的克隆演變過程

3.1 演變過程的多樣性

白血病的克隆演變是一個多步驟、發(fā)展性的動態(tài)演變過程。不同疾病的演變過程存在差異，即使同一疾病也存在著多種不同的演變過程。Anderson等[15]通過熒光原位雜交技術(shù)模擬重建ALL的克隆演變過程，發(fā)現(xiàn)最簡單的是僅有3個亞克隆組成的線性演變模式，而復雜者有超過10個亞克隆組成的分支樹狀模式。

3.2 白血病的克隆演變模式

白血病的克隆演變模式，正是基因突變組合隨時間推移的不同積累模式。在已發(fā)現(xiàn)的三種關(guān)于AML的克隆演變模式中，較為經(jīng)典的是早期發(fā)現(xiàn)的、在原發(fā)AML患者中檢測到的克隆演變模式，AML患者首先獲得AML1-ETO突變，而后在此基礎上獲得RUNX1、CEBPA或FLT3等突變。有研究[16-17]發(fā)現(xiàn)了關(guān)于原發(fā)AML及繼發(fā)性AML的演變模式。原發(fā)AML的一種演變模式是：患者首先獲得DNMT3A突變，而后獲得IDH2突變并一直保持該突變，隨后再獲得NPM 1突變，并在此基礎上獲得FLT3或RAS突變，最終形成AML克隆[16]。而另一種模式是關(guān)于繼發(fā)性AML的克隆演變，患者首先獲得U2AF1突變，而后獲得ASXL1突變，在此基礎上獲得IDH2突變，最終形成AML克隆[17]。與繼發(fā)性AML相比，原發(fā)AML涉及的基因突變步驟較少，這也許可以解釋原發(fā)性AML好發(fā)于較年輕者、而繼發(fā)于MDS的AML則好發(fā)于老年人的原因。

白血病的克隆演變過程有多個基因參與，一些基因異常在AML診斷和復發(fā)過程中都會存在，而另一些基因異常則在復發(fā)時可能會丟失，前者可以被認為是AML發(fā)生過程中的驅(qū)動基因異常。Luise等[18]通過深度測序法對核型正常的AML患者進行研究后發(fā)現(xiàn)，在AML緩解后檢測不到FLT3和NRAS等非驅(qū)動基因突變，而53%（25/47）的AML在緩解后仍可以檢測到驅(qū)動基因突變，這些驅(qū)動基因突變會隨著AML病情的變化而變化。DNMT3A、TET2、RUNX1和IDH2在AML緩解期中持續(xù)存在的頻率分別為28%、11%、6%和4%。DNMT3A在緩解期持續(xù)存在提示可能存在更早的復發(fā)（270天和508天，P＝0.111）。在對外周T細胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphomas，PTCL）患者的研究中，TET2突變、DNMT3突變不僅出現(xiàn)在T細胞腫瘤中，也可見于正常淋巴細胞及髓系祖細胞中。這些突變起源于造血分化過程中的不成熟期，當正常細胞獲得驅(qū)動基因突變后，會使其具備向惡性克隆演變的傾向[19-20]。

血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生至少需兩個以上的遺傳學打擊才能發(fā)生病變。驅(qū)動基因突變使細胞具備惡性克隆演變的傾向，在驅(qū)動突變基礎上的二次打擊是形成惡性克隆的直接原因。Welch等[21]通過對AML-M3測序并與核型正常的AML-M1樣本及正常人造血干/祖細胞（hematopoietic stem/ progenitor cells，HSPC）基因組進行比較，發(fā)現(xiàn)AML基因組的大多數(shù)基因突變可隨機發(fā)生在正常人的HSPC中，在此基礎上僅出現(xiàn)1～2個額外的、起協(xié)同作用的基因突變就可以產(chǎn)生腫瘤的基礎克隆，腫瘤的基礎克隆再獲得額外的、起協(xié)同作用的基因突變就可出現(xiàn)疾病進展或復發(fā)過程中的各種亞克隆。

TET2、ASXL1、DNMT3A等驅(qū)動基因突變可長期存在于正常人造血細胞中，而FLT3、NPM1等非驅(qū)動基因突變往往出現(xiàn)較晚，與亞克隆的特性有關(guān)[22]。在慢性粒單核細胞白血病的克隆演變過程中，TET2基因突變可使細胞發(fā)生驅(qū)動性突變并長期潛伏，當發(fā)生二次損傷時，如SRSF2基因突變，可導致異常分化，產(chǎn)生惡性克隆[23]。

4 克隆演變與耐藥機制

腫瘤的基因型和表型變化在時間和空間上是一個動態(tài)演變的過程，腫瘤異質(zhì)性可以由潛在突變引起，也可產(chǎn)生于細胞周期隨機突變?？寺⊙葑冃纬傻哪[瘤異質(zhì)性是治療失敗的重要原因，多藥耐藥可能形成于多途徑治療期間。腫瘤化療在克隆演變過程中形成了選擇壓力，耐藥性產(chǎn)生的分子機制隨藥物種類的不同而不同，即使同一藥物也存在著多種耐藥機制[24]。

化療壓力下腫瘤的克隆演變過程，正是內(nèi)環(huán)境因素與藥物共同作用的選擇過程。在一項針對149例CLL患者的研究中，選取18例患者進行全染色體測序和基因分析（其中12例采取化療，6例未化療），發(fā)現(xiàn)化療組中有10例（10/12）發(fā)生了克隆演變，未予化療的對照組僅1例（1/6）發(fā)生了克隆演變；在化療組發(fā)生克隆演變的10例患者中，5例為分支演變，5例為線性演變[25]。研究資料表明[24]，腫瘤耐藥性出現(xiàn)前的一些非優(yōu)勢亞克隆可能是治療后出現(xiàn)耐藥的潛在原因，在化療壓力下，優(yōu)勢腫瘤克隆發(fā)生新突變，也是腫瘤耐藥機制形成的重要原因。

5 克隆演變與腫瘤復發(fā)

白血病復發(fā)一直是白血病治療方面的一個難題，也是很多患者死亡的重要原因。化療作用下腫瘤克隆演變進程直接關(guān)系著腫瘤的復發(fā)過程。Corces-Zimmerman等[16]對緩解期AML患者體內(nèi)出現(xiàn)的白血病前期基因突變進行了分析，發(fā)現(xiàn)白血病前期突變存在于CD34+祖細胞和各種成熟細胞中，表明這些擁有白血病前期基因突變的HSC能夠在化療中存活，可成為腫瘤復發(fā)的潛在來源。同時，他們根據(jù)對患者復發(fā)與初診時樣本進行的全基因組測序?qū)Ρ冉Y(jié)果，提出腫瘤復發(fā)可能的幾種克隆演變模式：①在初診時優(yōu)勢克隆的基礎上獲得了新的基因突變；②由初診時非優(yōu)勢亞克隆發(fā)展而來；③治療不徹底，由微小殘余病灶復發(fā)而來，仍是初診時的優(yōu)勢克??；④由具有白血病前基因突變的HSC獲得新的基因突變形成。

在白血病患者中，TET2、IDH1/2、DNMT3A等早期基因突變在初診和復發(fā)時都較穩(wěn)定，而FLT3和RAS等突變在初診和復發(fā)時出現(xiàn)的情況具有較大波動性。因此，選擇適當?shù)幕蛲蛔冏鳛槟[瘤復發(fā)檢測指標具有一定的挑戰(zhàn)性，選用TET2、IDH1/2等持續(xù)存在的突變作為檢測指標的特異性會較差，而選用FLT3、RAS等突變作為檢測指標的敏感度則較低。有研究[26]發(fā)現(xiàn)：運用實時熒光定量PCR將NPM 1作為檢測指標可以有效檢測出AML中的微小殘余病灶；同時，NPM1也是AML患者一線治療期間評估預后的有效指標。

6 結(jié)語與展望

白血病的克隆演變過程是一個多步驟、順序性的突變累積過程。白血病優(yōu)勢克隆的產(chǎn)生，正是機體內(nèi)環(huán)境、藥物選擇與各種亞克隆自身適應性相博弈的結(jié)果。隨著新一代測序的普及、RNA-seq技術(shù)的發(fā)展及全基因組關(guān)聯(lián)性分析等方法的運用，研究者們對于白血病克隆演變的認識取得了一定的突破，同時也為臨床工作提供了一些思路：①是否可根據(jù)不同的克隆演變機制將疾病進行更為細致的分型并加以研究？②化療方案是否應同時考慮已出現(xiàn)的、可能成為復發(fā)來源的非優(yōu)勢亞克??？③針對持續(xù)存在的驅(qū)動基因突變進行靶向化療是否可以取得更好的療效？由于克隆演變進程本身的復雜性及科學技術(shù)的限制性，尚有很多問題不能找到答案。相信在不久的將來，隨著新一代測序技術(shù)的普及和測序分析技術(shù)的完善，研究者們一定會對白血病克隆演變過程有更加深入的認識。

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2015-04-02）