SSR標(biāo)記技術(shù)及其在楊梅上的應(yīng)用

張紹陽(yáng)，姚 永，羅 靜，徐昌杰(．銅仁學(xué)院生物與農(nóng)林工程學(xué)院梵凈山特色動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁554300;2．浙江大學(xué)果實(shí)品質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室/浙江省園藝植物整合生物學(xué)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州30058)

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，又稱(chēng)為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是在生物基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的基本序列單元(或基序)多次重復(fù)串聯(lián)構(gòu)成的DNA序列，序列長(zhǎng)度一般不超過(guò)200 bp［1］。SSR標(biāo)記技術(shù)可用于果樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性、進(jìn)化與分類(lèi)、品種鑒定、同物異名和同名異物品種的鑒別、無(wú)性系和體細(xì)胞突變的鑒別、DNA指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源保存和利用以及分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等研究，是目前果樹(shù)遺傳育種研究廣泛應(yīng)用的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)［2-4］。

楊梅(2n=16)，又名朱紅、樹(shù)莓或龍晴，亞熱帶常綠喬木或灌木雌雄異株果樹(shù)，為楊梅科(Myricaceae)楊梅屬(Myrica L．)植物［5］;在我國(guó)，本屬植物有 6 種和 5 個(gè)變種(變型)，栽培楊梅品種有305個(gè)，品系為120個(gè)，均屬于楊梅(M．rubra)種［6-7］。楊梅是我國(guó)南方地區(qū)特色水果［7］，其果實(shí)于5月底～7月初成熟，成熟果實(shí)色澤鮮艷，柔嫩多汁，風(fēng)味獨(dú)特，果實(shí)含鉀量高，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)療保健價(jià)值［8-10］。楊梅具有較高的栽培經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)為浙江省第二大果樹(shù)經(jīng)濟(jì)作物(僅次于柑橘)。

自2006年日本學(xué)者Terakawa等［11］報(bào)道楊梅SSR標(biāo)記研究以來(lái)，近年來(lái)陸續(xù)有楊梅SSR標(biāo)記相關(guān)研究的報(bào)道，這些研究很好地推進(jìn)了楊梅種質(zhì)資源研究工作?；诖?，筆者先對(duì)SSR標(biāo)記主要技術(shù)特性進(jìn)行概述，再對(duì)SSR標(biāo)記技術(shù)在楊梅上的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 SSR標(biāo)記技術(shù)概述

1．1 SSR位點(diǎn)的類(lèi)型及其特征 SSR位點(diǎn)廣泛分布于植物基因組的不同位置，SSR位點(diǎn)不僅數(shù)量眾多，而且也存在各種類(lèi)型。在植物全基因組上，SSR位點(diǎn)數(shù)量可達(dá)104～105，廣泛存在于基因組的各個(gè)區(qū)域，每隔10～50 kb就有1個(gè)SSR位點(diǎn)存在，SSR重復(fù)單位的堿基組成和重復(fù)次數(shù)因物種而異［2-3］。

依據(jù)重復(fù)單元(或基序)堿基個(gè)數(shù)不同，SSR可分為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸等重復(fù)類(lèi)型。對(duì)于上述幾種類(lèi)型的SSR在全基因組上的構(gòu)成，不同植物其構(gòu)成也不盡相同。據(jù)報(bào)道，單核苷酸SSR在所有植物全基因組上數(shù)量最多(而且都是以A/T重復(fù)SSR為主)，五和六堿基核苷酸SSR明顯少于其他類(lèi)型的SSR;各種類(lèi)型的SSR頻率(即在全基因組上總體數(shù)量)隨著重復(fù)次數(shù)增加而逐漸降低［12-14］。在葡萄和蘋(píng)果上，二核苷酸SSR數(shù)量?jī)H次于單核苷酸SSR，且AT/TA重復(fù)的SSR占該類(lèi)型SSR總量的30%以上，三核苷酸SSR同單核苷酸SSR與二核苷酸SSR一起構(gòu)成該類(lèi)型植物基因組SSR的主體［12-13］;在擬南芥、水稻、大豆、玉米、高粱、苜蓿和楊樹(shù)等植物上，單核苷酸至四核苷酸4種重復(fù)類(lèi)型SSR占此幾種植物全基因組SSR的絕大多數(shù)，其他類(lèi)型SSR僅為總SSR的10%左右［14］。在葡萄上，SSR主要分布在基因間隔區(qū)，其次在基因的非翻譯區(qū)，基因編碼區(qū)SSR密度最小;三核苷酸SSR和六核苷酸SSR比其他SSR在編碼區(qū)豐度要高，分別為19個(gè)/Mb和10個(gè)/Mb;數(shù)量豐富且易突變的二核苷酸SSR是開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的重要來(lái)源［12］。

依據(jù)重復(fù)序列長(zhǎng)度，Temnykh等［15］將SSR分為兩類(lèi)，第一類(lèi)為ClassⅠSSR(高度可變類(lèi)型)，其重復(fù)序列長(zhǎng)度不低于20 bp;第二類(lèi)為ClassⅡSSR(潛在可變類(lèi)型)，其重復(fù)序列長(zhǎng)度處于10～20 bp。依據(jù)核心序列排列方式不同，SSR可分為完全型、不完全型和復(fù)合型3種類(lèi)型。完全型SSR的核心序列以不間斷的重復(fù)方式首尾相連，目前研究的SSR大多屬于此類(lèi);不完全型SSR的核心序列在非末端有不多于3個(gè)非重復(fù)堿基;復(fù)合型SSR，是指由2個(gè)或2個(gè)以上的核心序列串聯(lián)組成的DNA片段，基本單元序列相同的2個(gè)核心序列之間要有不少于3個(gè)的非重復(fù)堿基［16］。后2種類(lèi)型SSR在植物基因組中也占有一定比例，但目前此2種SSR標(biāo)記研究很少。依據(jù)所在位點(diǎn)序列的來(lái)源，SSR也有3種類(lèi)型:來(lái)源于各種基因組DNA序列的普通SSR(即genomic SSR)，來(lái)自于各基因編碼區(qū)序列的EST-SSR(又可稱(chēng)為cDNA-SSR，cSSR或genic SSR)，以及來(lái)源自于細(xì)胞核外DNA序列的核外SSR(如葉綠體SSR和線(xiàn)粒體SSR等)。

1．2 SSR的遺傳特性 起初，SSR序列被認(rèn)為是一類(lèi)垃圾DNA序列，不轉(zhuǎn)錄也不發(fā)揮生理調(diào)控功能。后來(lái)發(fā)現(xiàn)SSR在基因組上并不是隨機(jī)分布的，一般基因間隔區(qū)DNA序列中SSR豐度比轉(zhuǎn)錄區(qū)高;在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、5'UTR(Untranslated regions，非翻譯區(qū))區(qū)、編碼區(qū)和3'UTR區(qū)，SSR豐度呈依次下降趨勢(shì);SSR序列也有其特定的生物功能，如編碼區(qū)SSR可導(dǎo)致蛋白質(zhì)種類(lèi)和功能改變，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)SSR能影響基因轉(zhuǎn)錄效率，位于UTR的SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度可影響下游基因的翻譯效率等［17-19］。不同生物種類(lèi)SSR構(gòu)成具有一定的特異性，SSR序列(包括基序種類(lèi)和重復(fù)數(shù)大小)隨著基因組位點(diǎn)不同而異，同一位點(diǎn)不同基因型生物個(gè)體SSR重復(fù)序列大小也可能有很大差異，SSR序列這種高度變異性就是SSR序列相關(guān)DNA標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生DNA片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分子基礎(chǔ)［20］。一般認(rèn)為，單個(gè)SSR位點(diǎn)在不同基因型個(gè)體之間的多態(tài)性主要是由于DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中堿基滑動(dòng)、錯(cuò)配或減數(shù)分裂過(guò)程中姐妹染色單體的不均等交換而造成［19，21-22］。

1．3 SSR標(biāo)記技術(shù)原理及特點(diǎn) SSR最初只是作為探針，用于真核生物基因組的RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性)研究。隨著PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)建立，SSR廣泛應(yīng)用于DNA標(biāo)記研究。基于SSR序列的多態(tài)性，即同一SSR位點(diǎn)在同種生物不同基因型的重復(fù)單元數(shù)有很大變化，產(chǎn)生了數(shù)種DNA標(biāo)記技術(shù)，如SSR標(biāo)記、ISSR(Inter-Simple Repeat Sequence，簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間)標(biāo)記［23］、RAMP(Random Amplified Microsatellite Polymorphisms，隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性)標(biāo)記［24］和 REMAP(Retrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphisms，逆轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性)標(biāo)記［25］。

SSR標(biāo)記技術(shù)是利用SSR序列比較保守的兩翼序列設(shè)計(jì)成對(duì)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同基因型樣品的同一位點(diǎn)SSR-PCR產(chǎn)物則有可能會(huì)在凝膠(現(xiàn)多為聚丙烯酰胺凝膠)電泳上呈現(xiàn)長(zhǎng)度的差異［26］。因SSR-PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上呈現(xiàn)DNA片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，SSR標(biāo)記又被稱(chēng)為SSLP(Simple Sequence Length Polymorphisms，簡(jiǎn)單序列重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣泛、呈共顯性遺傳和遺傳信息豐富等特點(diǎn)。同時(shí)，SSR標(biāo)記技術(shù)具有位點(diǎn)特異性、共顯性、對(duì)DNA需要量少、對(duì)DNA質(zhì)量要求不高、易于PCR檢測(cè)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便以及適合高通量分析等特點(diǎn)［27］。PCR標(biāo)記技術(shù)的重復(fù)性非常好，對(duì)于同一批SSR標(biāo)記分析，不同工作人員其試驗(yàn)結(jié)果有很好的一致性［28］。

1．4 SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā) 由于SSR標(biāo)記是特異引物標(biāo)記，必須先獲取相關(guān)DNA序列，以找出相應(yīng)SSR位點(diǎn)并依據(jù)其兩翼序列設(shè)計(jì)成對(duì)PCR引物，才能進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，所以SSR標(biāo)記技術(shù)存在引物開(kāi)發(fā)的問(wèn)題［29］。以往獲得SSR位點(diǎn)兩側(cè)序列或相應(yīng)特異引物，通常采用以下途徑:第一，利用SSR引物在近緣物種的通用性以及SSR引物具有很好的重復(fù)性能夠在不同實(shí)驗(yàn)室共享等特性，搜集相關(guān)研究(主要包括有關(guān)文獻(xiàn))中所用的SSR引物;第二，查詢(xún)相關(guān)生物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)(如NCBI和EMBL等)，下載研究物種相關(guān)DNA序列，對(duì)其進(jìn)行去冗余、去低質(zhì)量序列和序列拼接處理，再采用軟件(如Primer Premier 5．0或BatchPrimer 3等)設(shè)計(jì)引物;第三，構(gòu)建相關(guān)DNA或cDNA文庫(kù)，篩選SSR位點(diǎn)，然后根據(jù)兩翼序列設(shè)計(jì)引物［30］。

除一些模式植物或主要作物外，通過(guò)前2條途徑獲得的植物SSR引物數(shù)量通常極其有限，難以滿(mǎn)足遺傳育種應(yīng)用研究的需要，為此需要采用第3條途徑開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記。關(guān)于采用此途徑挖掘SSR位點(diǎn)或開(kāi)發(fā)相應(yīng)引物，目前報(bào)道有很多種策略［29，31-32］。然而，這些策略，其試驗(yàn)過(guò)程都非常復(fù)雜，而且還需要大量的測(cè)序，因此，通過(guò)此途徑開(kāi)發(fā)SSR引物費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要很高的試驗(yàn)費(fèi)用。而且，即便采用此方法挖掘SSR位點(diǎn)，所獲得SSR位點(diǎn)的數(shù)量也非常有限，使得SSR標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的更廣泛應(yīng)用受到了瓶頸性制約影響。

植物的一個(gè)全基因組或轉(zhuǎn)錄組上SSR位點(diǎn)十分豐富，其數(shù)量可達(dá)數(shù)萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)個(gè)［33］，這些SSR位點(diǎn)都是植物SSR標(biāo)記應(yīng)用研究所需要的寶貴資源。以前限于Sanger測(cè)序能力有限，從中開(kāi)發(fā)出的SSR標(biāo)記數(shù)量微乎其微。隨著近些年來(lái)新一代測(cè)序(Next-Generation Sequencing，NGS)技術(shù)與生物信息學(xué)工具異軍突起，通過(guò)全基因組測(cè)序或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序便可以將一個(gè)植物的整個(gè)基因組或轉(zhuǎn)錄組上絕大部分SSR位點(diǎn)挖掘出來(lái)，這為絕大多數(shù)植物SSR標(biāo)記大量開(kāi)發(fā)提供了一種重要捷徑［34-35］。

盡管植物基因組蘊(yùn)含的SSR位點(diǎn)數(shù)量比轉(zhuǎn)錄組含有的SSR位點(diǎn)數(shù)量高出幾倍甚至數(shù)十倍［33］，但基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的相關(guān)研究仍發(fā)展較快。究其原因，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已逐步取代基因芯片技術(shù)成為目前在全基因組水平上研究基因表達(dá)的主流方法。通過(guò)該技術(shù)，可以獲得某一生物樣品的低表達(dá)基因、不同樣品間的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度以及SNP等重要結(jié)果［35-36］。進(jìn)行SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)研究，也已逐漸成為植物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的一項(xiàng)重要內(nèi)容。而且，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的SSR都是ESTSSR，其序列都是轉(zhuǎn)錄本，因而這些SSR可能會(huì)與某些功能基因相關(guān)，開(kāi)發(fā)出來(lái)的SSR標(biāo)記有可能成為與某些生物表型性狀相關(guān)的分子標(biāo)記［37］。另外，雖然轉(zhuǎn)錄組EST-SSR多態(tài)性比基因組SSR低，但在近緣關(guān)系的植物之間可能有更好的通用性［38］。近年來(lái)，已有很多植物(包括楊梅)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了大量的 SSR標(biāo)記［34，38-48］，與基于新一代測(cè)序技術(shù)開(kāi)展的全基因組 SSR標(biāo)記研究，如在楊梅［49-50］、可可［51］、玉米［52］、芝麻［53］、棗［54］、白菜［55］等植物上，相得益彰。

2 楊梅SSR標(biāo)記研究概況

2．1 國(guó)外研究概況 楊梅是我國(guó)特色栽培果樹(shù)，其在國(guó)外分布很少，關(guān)于楊梅SSR標(biāo)記研究也僅有2篇報(bào)道。2006年，Terakawa等［11］從富集CT重復(fù)序列的楊梅基因組文庫(kù)克隆文庫(kù)中開(kāi)發(fā)出了13個(gè)SSR標(biāo)記，并對(duì)32個(gè)楊梅樣品進(jìn)行了標(biāo)記鑒別和遺傳多樣性分析。2009年，Terabawa等［56］又利用其中10個(gè)SSR標(biāo)記，分析所研究區(qū)域福島獼猴糞便所含楊梅種子的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)福島獼猴散播種子在楊梅種群遺傳多樣性的形成和維持中起著重要作用。

2．2 國(guó)內(nèi)研究概況 國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)楊梅SSR標(biāo)記研究已有8篇(有7篇為外文)，除其中1篇(Xie等［57］)作者所在單位為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所外，其他7篇均由浙江大學(xué)果樹(shù)科學(xué)研究所的研究者發(fā)表。

2009年，Zhang等［58］從‘荸薺’楊梅不同組織 EST文庫(kù)克隆片段序列和克隆的MYB相關(guān)基因cDNA序列中分別獲得了9個(gè)和2個(gè)SSR位點(diǎn)，并用保存在浙江省余姚市的中國(guó)楊梅資源圃［7］中的32個(gè)楊梅品種分析了各個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性特征。2011年，Xie等［59］利用已研究的14個(gè) SSR標(biāo)記［11，58］，采用熒光SSR標(biāo)記技術(shù)，對(duì)保存在上述楊梅資源圃?xún)?nèi)的122個(gè)楊梅樣品(主要來(lái)源于我國(guó)7個(gè)省)和1個(gè)蠟楊梅(M．cerifera)樣品進(jìn)行了遺傳聚類(lèi)分析，將其分為幾個(gè)類(lèi)別，并發(fā)現(xiàn)同一地理區(qū)域的樣品遺傳差異相對(duì)較小;又用其中的10個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了52個(gè)主要樣品的DNA指紋圖譜;發(fā)現(xiàn)楊梅的SSR引物可以通用于蠟楊梅相關(guān)研究。Xie等［57］以G(G/C)G(GT)6作為富集SSR序列的引物，利用ISSR抑制PCR法，從‘黑晶’楊梅基因組DNA中獲得了完全型和復(fù)合型SSR位點(diǎn)各6對(duì)引物，并用24個(gè)楊梅和2個(gè)矮楊梅(M．nana)作為樣品進(jìn)行篩選，從中開(kāi)發(fā)出了9個(gè)SSR標(biāo)記，該研究為楊梅或其他一些植物SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了一種策略或思路。

2012 年，Jiao等［49］采用Illumina Hi-Seq 2000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)用楊梅株系‘C1020-55’所構(gòu)建250和500 bp的基因組文庫(kù)進(jìn)行高通測(cè)序，產(chǎn)生了9．01 Gb序列數(shù)據(jù)(楊梅基因組323 Mb的26倍覆蓋度)，應(yīng)用 MISA(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa/misa．html)從初步拼接的各 scaffold序列片段(總大小為255 Mb)中鑒別出28，602個(gè)SSR位點(diǎn)(不含單核苷酸和非完全型SSR位點(diǎn))，發(fā)現(xiàn)二核苷酸SSR數(shù)量最大(占總量的 84．73%)，用 BatchPrimer3 軟件(http://pgrc．ipk-gatersleben．de/misa)設(shè)計(jì)引物，從中選取600對(duì)引物，并用29個(gè)楊梅和3個(gè)楊梅屬其他植物樣品進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選出158個(gè)SSR標(biāo)記(每個(gè)SSR位點(diǎn)平均可產(chǎn)生8．25個(gè)等位條帶，多態(tài)性信息含量平均為0．67)，并對(duì)所獲得SSR標(biāo)記在楊梅屬植物間的通用性進(jìn)行了分析?；贔eng等［60］的‘荸薺’楊梅Illumina Hi-Seq 2000轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)重頭拼接所獲得41 239條 Unigenes序列(總大小為20．9 Mb，平均大小為539 bp)，Zhang等［43］利用MISA軟件鑒別ESTSSR位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)6883個(gè)EST-SSR位點(diǎn)位于5 472條Unigenes上(出現(xiàn)頻率為每3．2 Kb含1個(gè) EST-SSR位點(diǎn))，每個(gè)位點(diǎn)序列長(zhǎng)度為10～48 bp，二核苷酸和三核苷酸EST-SSR位點(diǎn)所占比例超過(guò)總量的75%，有1326個(gè)EST-SSR位點(diǎn)包含在594個(gè)復(fù)合EST-SSR序列中，其他5557個(gè)位點(diǎn)則為完全型ESR-SSR;從6 151個(gè)EST-SSR中，選取412個(gè)用于設(shè)計(jì)SSR引物，成功設(shè)計(jì)267對(duì)引物，并用10個(gè)楊梅主要品種(系)，篩選出109個(gè)EST-SSR標(biāo)記(產(chǎn)生了389個(gè)等位片段，多態(tài)性比率為 93．8%)。

2014 年，Jia等［50］基于 Jiao等［49］高通測(cè)序結(jié)果又開(kāi)發(fā)出了107個(gè)SSR標(biāo)記。至此，楊梅研究可用的SSR標(biāo)記(包括EST-SSR標(biāo)記)由2012年前的36個(gè)上升至410個(gè)，為楊梅種質(zhì)資源SSR標(biāo)記研究奠定了良好基礎(chǔ)。在上述研究中，Jia等［50］用所獲得全部SSR標(biāo)記對(duì)45個(gè)楊梅樣品進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，確認(rèn)了研究小組前期研究結(jié)論，使得各主要楊梅品種(品系)遺傳關(guān)系更為明確;優(yōu)系‘Y2010-70’、‘Y2012-140’及‘Y2012-145’也被從基因型上確定為新品系。汪國(guó)云等［61］基于 Xie等［57］構(gòu)建的楊梅品種鑒別指紋圖譜結(jié)果，選用相同的引物，對(duì)9個(gè)楊梅品種，基于遺傳測(cè)序儀高效和自動(dòng)化特性，構(gòu)建了多重?zé)晒釹SR標(biāo)記鑒別DNA指紋圖譜，為相應(yīng)果實(shí)質(zhì)量檢測(cè)及優(yōu)良品系選擇提供了很大便利。

2015 年，基于前期研究［43］，Zhang 等［62］對(duì)楊梅 11 個(gè)類(lèi)型EST-SSR的多態(tài)性(包括多態(tài)性比率和單個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性水平)比較研究，發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型EST-SSR多態(tài)性差異十分顯著，研究結(jié)果對(duì)于楊梅和其他果樹(shù)轉(zhuǎn)錄組(或基因組)多態(tài)性SSR標(biāo)記的高效率篩選具有較好的參考作用。

3 總結(jié)與展望

SSR標(biāo)記技術(shù)具有其他DNA標(biāo)記技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，新一代測(cè)序技術(shù)能夠大大推動(dòng)許多植物SSR標(biāo)記的大量開(kāi)發(fā)，SSR標(biāo)記技術(shù)也將得到更為廣泛的應(yīng)用。作為我國(guó)特色的果樹(shù)種質(zhì)資源，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)楊梅SSR標(biāo)記研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展，開(kāi)發(fā)了眾多的SSR標(biāo)記，并在一定程度明確了許多重要楊梅品系的親緣關(guān)系，為后續(xù)更多的楊梅種質(zhì)資源SSR標(biāo)記研究奠定了良好基礎(chǔ)。

［1］TAUTZ D．Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers［J］．Nucleic Acids Research，1989，17:6463-6471．

［2］高志紅，章鎮(zhèn)，韓振海．SSR技術(shù)及其在果樹(shù)上的應(yīng)用［J］．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2002，19(5):281-285．

［3］劉闖萍，王軍．SSR標(biāo)記及其在葡萄上的應(yīng)用［J］．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2008，25(1):93-101．

［4］王娟，宋尚偉．SSR標(biāo)記在蘋(píng)果種質(zhì)資源及遺傳育種研究中的應(yīng)用［J］．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(5):16-20．

［5］CHEN K S，XU C J，ZHANG B，et al．Red bayberry:Botany and horticulture［J］．Horticultural Reviews，2004，30:83-114．

［6］李興軍，呂均良，李三玉．中國(guó)楊梅研究進(jìn)展［J］．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，17(2):224-229．

［7］陳方永．我國(guó)楊梅研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)［J］．中國(guó)南方果樹(shù)，2012，41(5):31-36．

［8］何新華，陳力耕，陳怡，等．中國(guó)楊梅資源及利用研究評(píng)述［J］．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2004，41(5):467-471．

［9］ZHANG W S，LI X，ZHENG J T，et al．Bioactive components and antioxidant capacity of Chinese bayberry(Myrica rubra Sieb．a(chǎn)nd Zucc．)fruit in relation to fruit maturity and postharvest storage［J］．European Food Research and Technology，2008，227(4):1091-1097．

［10］SUN C D，HUANG H Z，XU C J，et al．Biological activities of extracts from Chinese bayberry(Myrica rubra Sieb．et Zucc．):A review［J］．Plant Foods for Hum Nutrition，2013，68(2):97-106．

［11］TERAKAWA M，KIKUCHI S，KANETANI S，et al．Characterization of 13 polymorphic microsatellite loci for an evergreen tree，Myrica rubra［J］．Molecular Ecology Notes，2006，6:709-711．

［12］蔡斌，李成慧，姚泉洪，等．葡萄全基因組SSR分析和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建［J］．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(4):28-32．

［13］關(guān)玲，章鎮(zhèn)，王新衛(wèi)，等．蘋(píng)果基因組SSR位點(diǎn)分析與應(yīng)用［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(21):4415-4428．

［14］CAVAGNARO P F，SENALIK D A，YANG L M，et al．Genome-wide characterization of simple sequence repeats in cucumber(Cucumis sativus L．)［J］．BMC Genomics，2010，11:569．

［15］TEMNYKH S，DECLERCK G，LUKASHOVA A，et al．Computational and experimental analysis of microsatellites in rice(Oryza sativa L．):Frequency，length variation，transposon associations，and genetic marker potential［J］．Genome Research，2001，11(8):1441-1452．

［16］WEBER J L．Informativeness of human(dC-dA)n．(dG-dT)n polymorphisms［J］．Genomics，1990，7(4):524-530．

［17］LI Y C，KOROL A B，F(xiàn)AHIMA T，et al．Microsatellites within genes:Structure，function，and evolution［J］．Molecular Biology and Evolution，2004，21(6):991-1007．

［18］KASHI Y，KING D G．Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolution［J］．Trends in Genetics，2006，22(5):253-259．

［19］李珊珊，孫春玉，蔣世翠，等．SSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用［J］．吉林蔬菜，2014(5):33-37．

［20］MATSUOKA Y，MITEHELL S E，KRESOVICH S，et al．Microsatellites in Zae-variability，patterns of mutations，and use for evolutionary studies［J］．Theroretical and Applied Genetics，2002，104(2/3):436-450．

［21］ SCHL?TTERER C，TAUTZ D．Slippage synthesis of simple sequence DNA［J］．Nucleic Acids Research，1992，20(2):211-215．

［22］KRUGLYAK S，DURRETT R T，SCHUG M D，et al．Equilibrium distributions of microsatellite repeat length resulting from a balance between slippage events and point mutations［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95(18):10774-10778．

［23］ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D．Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain-reaction amplification［J］．Genomics，1994，20(2):176-183．

［24］WU K S，JONES R，DANNEBERGER L，et al．Detection of microsatellite polymorphisms without cloning［J］．Nucleic Acids Research，1994，22(15):3257-3258．

［25］KALENDAR R，GROB T，REGINA M，et al．IRAP and REMAP:Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques［J］．Theoretical and Applied Genetics，1999，98(5):704-711．

［26］MORGANTE M，OLIVIERI A M．PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics［J］．The Plant Journal，1993，3(1):175-182．

［27］WEISING K，WINTER P，HüTTEL B，et al．Microsatellite markers for molecular breeding［J］．Journal of Crop Production，1997，1(1):113-143．

［28］MAROOF M，BIYASHEV R M，YANG G P，et al．Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley-species-diversity，chromosomal locations，and population-dynamics［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91(12):5466-5470．

［29］李明芳，鄭學(xué)勤．開(kāi)發(fā) SSR 引物方法之研究動(dòng)態(tài)［J］．遺傳，2004，26(5):769-776．

［30］陸丹，牛楠，李玥瑩．SSR標(biāo)記技術(shù)在植物基因組研究上的應(yīng)用［J］．沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，28(1):83-85．

［31］ZANE L，BARGELLONI L，PATARNELLO T．Strategies for microsatellite isolation:A review［J］．Molecular Ecology，2002，11(1):1-16．

［32］張?jiān)龃洌钕擦郑甋SR 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)策略及評(píng)價(jià)［J］．遺傳，2004，26(5):763-768．

［33］LA ROTA M，KANTETY R V，YU J K，et al．Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice，wheat，and barley［J］．BMC Genomics，2005，6:23．

［34］ZALAPA J E，CUEVAS H，ZHU H Y，et al．Using next-generation sequencing approaches to isolate simple sequence repeat(SSR)loci in the plant sciences［J］．American Journal of Botany，2012，99(2):193-208．

［35］岳桂東，高強(qiáng)，羅龍海，等．高通量測(cè)序技術(shù)在動(dòng)植物領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］．中國(guó)科學(xué):生命科學(xué)，2012，42(2):107-124．

［36］楊曉玲，施蘇華，唐恬．新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景［J］．生物技術(shù)通報(bào)，2010(10):76-84．

［37］VARSHNEY R K，NAYAK S N，MAY G D，et al．Next-generation sequencing technologies and their implications for crop genetics and breeding［J］．Trends in Biotechnology，2009，27:522-530．

［38］WANG Z Y，F(xiàn)ANG B P，CHEN J Y，et al．De novo assembly and characterization of root transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of cSSR markers in sweet potato(Ipomoea batatas)［J］．BMC Genomics，2010，11:726．

［39］PARCHMAN T L，GEIST K S，GRAHNEN J A，et al．Transcriptome sequencing in an ecologically important tree species:Assembly，annotation，and marker discovery［J］．BMC Genomics，2010，11:180．

［40］DUTTA S，KUMAWAT G，SINGH B P，et al．Development of genic-SSR markers by deep transcriptome sequencing in pigeonpea［Cajanus cajan(L．)Millspaugh］［J］．BMC Plant Biology，2011，11:17．

［41］KAUR S，COGAN N，PEMBLETON L W，et al．Transcriptome sequencing of lentil based on second-generation technology permits large-scale Unigene assembly and SSR marker discovery［J］．BMC Genomics，2011，12:265．

［42］WEI W L，QI X Q，WANG L H，et al．Characterization of the sesame(Sesamum indicum L．)global transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of EST-SSR markers［J］．BMC Genomics，2011，12:451．

［43］ZHANG S Y，LI X，F(xiàn)ENG C，et al．Development and characterization of 109 polymorphic EST-SSRs derived from Chinese bayberry(Myrica rubra，Myricaceae)transcriptome［J］．American Journal of Botany，2012，99(12):501-507．

［44］劉峰，王運(yùn)生，田雪亮，等．辣椒轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及其多態(tài)性分析［J］．園藝學(xué)報(bào)，2012，39(1):168-174．

［45］王麗鴛．基于EST數(shù)據(jù)庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的茶樹(shù)DNA分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究［D］．杭州:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，2011．

［46］YUE X Y，LIU G Q，ZONG Y，et al．Development of genic SSR markers from transcriptome sequencing of pear buds［J］．Journal of Zhejiang University Science B:Biomedicine ＆ Biotechnology，2014，15(4):303-312．

［47］MENG M，TANG W，LIU J，et al．Development of EST-SSR markers in Actinidia chinensis cv‘Hongyang’based on transcriptomic sequences［J］．Chinese Journal of Applied ＆ Environmental Biology，2014，20(4):564-570．

［48］鄢秀芹，魯敏，安華明．刺梨轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析及其分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)［J］．園藝學(xué)報(bào)，2015，42(2):341-349．

［49］JIAO Y，JIA H M，LI X W，et al．Development of simple sequence repeat(SSR)markers from a genome survey of Chinese bayberry(Myrica rubra)［J］．BMC Genomics，2012，13:201．

［50］JIA H M，SHEN Y T，JIAO Y，et al．Development of 107 SSR markers from whole genome shotgun sequences of Chinese bayberry(Myrica rubra)and their application in seedling identification［J］．Journal of Zhejiang University Science B:Biomedicine ＆ Biotechnology，2014，15(11):997-1005．

［51］黃恒春，王毅，黃莉莎，等．可可全基因組SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及分析［J］．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，44(3):340-344．

［52］原志敏．玉米全基因組SSRs分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與特征分析［D］．雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013．

［53］WEI X，WANG L H，ZHANG Y X，et al．Development of simple sequence repeat(SSR)markers of sesame(Sesamum indicum)from a genome survey［J］．Molecules，2014，19(4):5150-5162．

［54］XIAO J，ZHAO J，LIU M J，et al．Genome-wide characterization of simple sequence repeat(SSR)loci in Chinese Jujube and Jujube SSR primer transferability［J］．PloS One，2015，10(5):127812．

［55］SONG X M，GE T T，LI Y，et al．Genome-wide identification of SSR and SNP markers from the non-heading Chinese cabbage for comparative genomic analyses［J］．BMC Genomics，2015，16:328．

［56］TERAKAWA M，ISAGI Y，MATSUI K，et al．Microsatellite analysis of the maternal origin of Myrica rubra seeds in the feces of Japanese macaques［J］．Ecology Research，2009，24:663-670．

［57］XIE X B，QIU Y Y，KE L P，et al．Microsatellite primers in red bayberry，Myrica rubra(Myricaceae)［J］．American Journal of Botany，2011，98(4):93-95．

［58］ZHANG S M，XU C J，GAO Z S，et al．Development and characterization of microsatellite markers for Chinese bayberry(Myrica rubra Sieb．＆Zucc．)［J］．Conservation Genetics，2009，10(5):1605-1607．

［59］XIE R J，ZHOU J，WANG G Y，et al．Cultivar identification and genetic diversity of chinese bayberry(Myrica rubra)accessions based on fluorescent SSR markers［J］．Plant Molecular Biology Reporter，2011，29(3):554-562．

［60］FENG C，CHEN M，XU C J，et al．Transcriptomic analysis of Chinese bayberry(Myrica rubra)fruit development and ripening using RNA-Seq［J］．BMC Genomics，2012，13:19．

［61］汪國(guó)云，周劍，沈禹彤，等．應(yīng)用多重?zé)晒釹SR標(biāo)記組合鑒定楊梅果實(shí)的品種來(lái)源［J］．中國(guó)南方果樹(shù)，2013，43(3):15-18．

［62］ZHANG S Y，F(xiàn)ENG C，XU C J，et al．Polymorphisms in different ESTSSR types derived from the Chinese bayberry(Myrica rubra，Myricaceae)transcriptome［J］．Genetics and Molecular Research，2015，14(2):6037-6041．