流式細(xì)胞術(shù)在營(yíng)養(yǎng)和食品衛(wèi)生評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展

李文華，胡茂志 ，嚴(yán)秋香，魏文嫻，崔桂友

（1.揚(yáng)州大學(xué)測(cè)試中心，江蘇揚(yáng)州225009;2.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009;3.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)胞分析技術(shù)，它集激光技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)以及熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體，具有檢測(cè)速度快、測(cè)量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分選純度高、方法靈活等特點(diǎn)。流式細(xì)胞儀(flow cytometer)是應(yīng)用FCM的有效工具，經(jīng)過多年的不斷發(fā)展和改進(jìn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基礎(chǔ)研究和臨床檢測(cè)［1］。在食品科學(xué)領(lǐng)域，隨著食品安全要求的提高，特別是在食品生產(chǎn)和加工過程中的質(zhì)量控制以及食品功能成分評(píng)價(jià)等方面，F(xiàn)CM已成為一種重要的分析技術(shù)，呈現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。筆者就其在營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。

1 流式細(xì)胞儀概述

流式細(xì)胞儀主要有4部分組成:流動(dòng)室和液流系統(tǒng)、光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)。具有分選功能的流式細(xì)胞儀還包括分選系統(tǒng)。將待測(cè)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，熒光標(biāo)記后，在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流動(dòng)室的檢測(cè)區(qū)域。用激光垂直照射檢測(cè)區(qū)的細(xì)胞流，被熒光標(biāo)記的細(xì)胞產(chǎn)生散射光和熒光，同時(shí)被前向光電二極管和側(cè)向90°方向的光電倍增管接收。前向散射光信號(hào)反映了細(xì)胞體積的相對(duì)大小，側(cè)向散射光信號(hào)反映了細(xì)胞內(nèi)顆粒性物質(zhì)的復(fù)雜程度。熒光信號(hào)代表了所標(biāo)記的細(xì)胞表面或內(nèi)部的分子信息，這些光信號(hào)被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C(jī)處理器形成數(shù)據(jù)文件。細(xì)胞分選是將待測(cè)液滴充以電荷，讓其在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入不同的收集管中，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離［2］。在食品科學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)CM是單細(xì)胞水平分析的有力工具。目前，已涉及多種參數(shù)的檢測(cè)，包括細(xì)胞活性、核酸含量、細(xì)胞凋亡、酶活性、膜電位、細(xì)胞內(nèi)pH測(cè)定等。

2 FCM在食品功能成分活性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

食品功能成分對(duì)人體細(xì)胞作用機(jī)制的分析，為評(píng)價(jià)食品功能和開發(fā)新的功能性食品提供了依據(jù)，而FCM在其中發(fā)揮了重要作用。

2.1 增強(qiáng)免疫方面的評(píng)價(jià) 保健營(yíng)養(yǎng)品酪蛋白糖巨肽(caseino-glycomacropeptide，CGMP)是κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶和胃蛋白酶酶解后形成的含有64個(gè)氨基酸的不同種類肽段，具有多種生物學(xué)活性和獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性，葉雷等用FCM研究了CGMP對(duì)小鼠腹腔免疫細(xì)胞及腸黏膜屏障的影響，發(fā)現(xiàn)CGMP可以增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)腸道黏膜免疫應(yīng)答，增強(qiáng)腸黏膜免疫屏障功能，有望開發(fā)為抑制腸道炎癥的功能性食品添加劑。另外，他們還研究了CGMP對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響，發(fā)現(xiàn)乳源CGMP能夠引起小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化，調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群的平衡。這說明，CGMP可作為功能性食品對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的失衡有緩解作用［3-4］。

n-3多不飽和脂肪酸食物主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。試驗(yàn)和臨床研究表明，n-3多不飽和脂肪酸可以用于治療自身免疫和過敏性炎癥。Mukaro等運(yùn)用FCM分析研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期食用富含n-3的食品，會(huì)降低NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的碘化活性(iodination activity)，提高淋巴細(xì)胞產(chǎn)生淋巴毒素的水平，從而降低炎性反應(yīng)和組織損傷［5］。

2.2 抗氧化方面的評(píng)價(jià) 大豆異黃酮(Soy isoflavone，SI)是主要存在于豆科植物中的一類植物雌激素。近年來，大量的研究表明，SI的抗氧化效應(yīng)介導(dǎo)了其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括防治心血管疾病、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、乳腺癌和前列腺癌等疾病，是一類優(yōu)良的天然抗氧化劑。染料木素(Genistein)，又稱染料木黃酮、金雀異黃酮，是大豆異黃酮的一種。張婷用FCM研究證實(shí)，染料木素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力下降和凋亡有保護(hù)作用，染料木素可濃度依賴的上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和GSH-Px的水平，并抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的SOD、CAT和GSH-Px水平的降低，表明其對(duì)內(nèi)源性抗氧化劑的上調(diào)是其抗氧化作用的重要機(jī)制之一［6］。

紅細(xì)胞膜病變是嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥。研究表明，n-3脂肪酸能降低脂質(zhì)過氧化作用，提高紅細(xì)胞膜中α-或γ-維生素E含量。Yang等利用FCM分析了紅細(xì)胞磷脂對(duì)稱性和膜脂肪酸的組成表明，富含n-3脂肪酸的麻子油可提高紅細(xì)胞的抗氧化能力，抑制高糖飲食引起的紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和膜變形［7］。

香菇多糖(Lentinan)是從香菇子實(shí)體中分離出的天然活性成分，因具有良好的抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和刺激干擾素形成等功效逐漸引起了人們的關(guān)注。Wang等用FCM分析了不同濃度香菇多糖喂養(yǎng)海參后的變化，發(fā)現(xiàn)一定濃度的香菇多糖刺激后會(huì)引起海參體腔細(xì)胞活力升高和吞噬作用明顯增強(qiáng)，同時(shí)也增加了體腔細(xì)胞內(nèi)的CAT和堿性磷酸酶的活力［8］。

2.3 抗腫瘤方面的評(píng)價(jià) 人類飲食中廣泛存在黃酮類化合物，Chang等利用FCM等分析了23種黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231和MCF-7)、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(LoVo和DLD-1)和前列腺癌細(xì)胞(PC3)的毒性發(fā)現(xiàn)，它們誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力存在差異，其中，3，6-二羥基黃酮(3，6-dihydroxylflavone)最強(qiáng)，并推測(cè)其可以作為癌癥的化療藥物來開發(fā)［9］。

海帶多糖(Laminaria polysaccharide)是從海帶中提取的含有多種單糖和硫酸基的水溶性雜多糖，研究表明，海帶多糖具有抗腫瘤的效果。Ji等通過FCM分析了海帶多糖誘導(dǎo)人LoVo細(xì)胞凋亡的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)海帶多糖通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而間接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞。它不僅能激活巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的生成，從多個(gè)方面抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)散［10］。

白藜蘆醇(resveratrol)是一種由植物產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)，主要存在于紅葡萄皮、豌豆、堅(jiān)果、藍(lán)莓、桑椹、蔓越莓、姜黃和菠菜等植物組織中。阿薩通過FCM分析細(xì)胞中GSHPx等抗氧化酶的活性發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶來達(dá)到抗腫瘤的效果［11］。

2.4 其他方面的評(píng)價(jià) 腸促胰素是人體內(nèi)一種腸源性激素，在進(jìn)食后，該類激素可促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。腸促胰素主要是由GLP-1(glucagon-like peptide-1)和 GIP(glucose-dependent insulinotropic peptide)組成，其中GLP-1對(duì)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有較大影響。Gonzalez-Abuin等通過FCM分析了葡萄籽原花青素提取物對(duì)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞(STC-1)的影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的葡萄籽原花青素提取物可通過促進(jìn)STC-1細(xì)胞分泌GLP-1來調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖平衡［12］。

高脂肪飲食會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，而循環(huán)微粒子(circulating microparticles，MPs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells)在高脂肪飲食后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞影響較大。Bulut等通過FCM分析了成人在高脂肪飲食后飲用礦泉水、可樂、紅酒以及白酒的影響，發(fā)現(xiàn)飲用可樂組MPs大量增加(增加了62%)，而紅酒組MPs增加量最小(增加5%)，因此認(rèn)為，高脂肪飲食后飲用少量紅酒可減少對(duì)機(jī)體的危害［13］。

食物過敏可引起皮膚、消化、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)的過敏癥狀并造成損害。中藥復(fù)方Formula-2(FAHF-2)由靈芝、干姜、黃柏、桂枝、川椒、烏梅、人參、當(dāng)歸和黃連9種中藥組成，被證明是安全有效的治療食物過敏的中藥。Patil等用FCM分析了FAHF-2的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)其可有效緩解食物過敏引起的嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞升高［14］。

此外，F(xiàn)CM還可應(yīng)用于臨床上兒童對(duì)牛奶的免疫耐受評(píng)價(jià)、食品添加劑的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)、黃酮類化合物的藥理潛能評(píng)價(jià)等，為保健食品和醫(yī)藥品的分析提供了科學(xué)依據(jù)。

3 FCM在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用

FCM發(fā)展于20世紀(jì)60年代，并迅速用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域分析哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在20世紀(jì)70年代后期開始用于微生物領(lǐng)域，但因微生物細(xì)胞體積比哺乳動(dòng)物細(xì)胞小，限制了微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用。1990年，F(xiàn)CM首次應(yīng)用于酒類釀造。之后，被廣泛運(yùn)用于面包發(fā)酵、釀酒等行業(yè)，并逐漸用于其他食品和飲料行業(yè)［15］。目前，在食品工業(yè)中，F(xiàn)CM已經(jīng)成為微生物檢測(cè)的常用工具。

3.1 細(xì)菌活性判斷方面的應(yīng)用 結(jié)合細(xì)菌活性染料，F(xiàn)CM可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的檢測(cè)。通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱或有無可知菌體活性的大小或有無，并且該方法可以檢測(cè)低活性的細(xì)胞，而如果使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法或亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)低活性細(xì)胞，則誤差較大。Schenk等分析紫外線照射對(duì)大腸桿菌ATCC11229、無害李斯特菌ATCC33090和釀酒酵母KE162的損傷發(fā)現(xiàn)，隨著紫外曝光的時(shí)間不同，細(xì)胞損傷程度也不同。短時(shí)間內(nèi)，大腸桿菌和釀酒酵母的PI陽性率增加，而無害李斯特菌由于膜破裂而全部被殺死［16］。葉雷等利用熒光染料標(biāo)記直投式發(fā)酵劑菌體細(xì)胞，分析了細(xì)菌的活力以及生存狀態(tài)［17］，這對(duì)科學(xué)評(píng)價(jià)各種微生物發(fā)酵劑的品質(zhì)具有現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 食品微生物的在線監(jiān)測(cè) 食品的生產(chǎn)一般是一個(gè)連續(xù)的流水線過程，最終產(chǎn)品是否合格依賴于各環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證，這就是實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的意義所在。Broger等設(shè)計(jì)出一種低通量FCM檢測(cè)系統(tǒng)(Flow injection flow cytometry)，用于實(shí)時(shí)、在線監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器中菌體生長(zhǎng)的變化過程。通過與其他熒光檢測(cè)方法比較發(fā)現(xiàn)，只有FCM可以從大量弱熒光信號(hào)的菌體中辨別出少量熒光信號(hào)強(qiáng)的菌體。并且發(fā)現(xiàn)，在菌體培養(yǎng)過程中，個(gè)體之間的異質(zhì)性明顯。因?yàn)榫褐芯w信號(hào)分散在一個(gè)較寬的范圍內(nèi)，因此設(shè)想，可以從中選擇高產(chǎn)量、穩(wěn)定的菌株［15，18］。由以上可知，該技術(shù)在產(chǎn)品實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方面具有傳統(tǒng)方法無法比擬的特點(diǎn)。

3.3 益生菌方面的應(yīng)用 益生菌(probiotics)是指一類自然存在的有益宿主的微生物。它們可促進(jìn)機(jī)體腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，最終達(dá)到提高抗病力和促生長(zhǎng)等益生作用。Geng等用FCM分析了4種商業(yè)乳制品中活的雙歧桿菌含量，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法相一致，但相較于傳統(tǒng)方法需72 h，F(xiàn)CM檢測(cè)方法僅在2 h內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，大大縮減了檢測(cè)時(shí)間［19］。Chen等用FCM方法檢測(cè)了乳酸菌DPC16對(duì)不同壓力的抵抗力，發(fā)現(xiàn)DPC16具有較強(qiáng)的耐酸性;另外，相較于其他糖類，乳糖可較好地保持凍干法處理后的 DPC16 的活性［20］。

3.4 食源性致病菌的檢測(cè) 食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)過程中的微生物污染造成的食源性疾病是食品安全中最突出的問題，盡管近年來人們不斷加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)管，致病菌污染食品的案例仍屢屢發(fā)生。FCM與免疫熒光抗體標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，通過檢測(cè)病原菌表面的特征性抗原，而特異性檢測(cè)食源性致病菌。目前，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于沙門菌(Salmonella)、大腸桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、單核細(xì)胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)等病原菌的檢測(cè)。并且，將染料之間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)與免疫熒光方法相結(jié)合，可以在一定程度上減小抗體的非特異性吸附，從而提高檢測(cè)靈敏度［21］。

4 小結(jié)與展望

在食品和飲料行業(yè)，進(jìn)行傳統(tǒng)常規(guī)檢測(cè)會(huì)大大延誤產(chǎn)品上市時(shí)間，而流式細(xì)胞術(shù)與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，具有檢測(cè)速度快、收集數(shù)據(jù)量大、分析全面、方法靈活、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為食品生產(chǎn)和加工過程中質(zhì)量檢測(cè)的一種較好的方法。雖然流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于食品行業(yè)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但該方法的推廣還是存在一些問題，如流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，檢測(cè)用微球和熒光染料成本較高，樣品前處理復(fù)雜等。針對(duì)這些問題，期望在今后流式細(xì)胞儀的發(fā)展過程中，可以研制出價(jià)格低廉的試劑，優(yōu)化樣品前處理技術(shù)，同時(shí)使檢測(cè)設(shè)備更便捷、易操作。相信在不久的將來，流式細(xì)胞術(shù)會(huì)更廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)。

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