桑葉中1-脫氧野尻霉素(DNJ)研究進展

鄒湘月，李飛鳴，邵元元，宋南平，張仟，顏新培(湖南省蠶?？茖W研究所，湖南長沙410127)

桑葉(Mulberry Leaf)史載于《神農本草經》，藥用歷史悠久。1993年它被列入國家衛(wèi)生部藥食兩用品種目錄。新版《中國藥典》［1］收錄它為主治風熱感冒、肺熱燥咳之要藥。桑葉含多種功能性成分。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)為主要的功能活性物質之一?，F(xiàn)代藥理研究證明，DNJ對小腸中的α-葡糖苷酶活性具有強競爭性抑制作用和抗腫瘤、抗病毒等藥理活性［2-4］，成為蠶桑綜合利用的一個研究熱點。筆者疏理了關于桑葉DNJ的相關研究成果，為后期有效獲得高含量、高純度的1-脫氧野尻霉素及開發(fā)利用桑葉提供參考。

1 影響DNJ含量的相關因素

自Yagi等［5］首次從桑根皮中分離得到DNJ以來，桑樹一直都是其最主要的植物來源。DNJ廣泛存在于桑樹的各組織中，以葉片最多，但其含量易受到桑樹品種、產地、采摘時期、部位、生長環(huán)境和施肥情況等因素的影響而呈現(xiàn)較大的含量差別。李有貴等［6］對來自云南不同地區(qū)的59份野生桑桑葉中DNJ含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)開遠地區(qū)的巖桑桑葉中DNJ含量高達0．791 1%，是目前報道的DNJ含量最高的桑樹資源。大量研究和實踐證明，由于氣溫高和雨水、光線充足，7、8月份桑葉中DNJ含量明顯高于10月和11月，尤其在相對成熟的夏季桑葉中DNJ含量最高［7-8］，而在相同條件下DNJ含量隨葉位由上到下遞減，依次為嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉［9］。目前，許多研究人員分析了桑樹生長條件對DNJ植物源的影響程度。殷浩等［10］研究表明，遮陰處理能顯著增加桑苗葉片中DNJ含量，且隨著遮陰程度的增加其含量明顯升高的結論。劉剛等［9］認為，氮肥、磷肥、鉀肥的施肥水平及其配比均能顯著影響DNJ含量，并推薦了最優(yōu)的生產施肥指標。另外，DNJ可直接從特定植物如鴨跖草［11］、風信子［12］和萬年青［13］等和家蠶、桑蟥、桑螟等昆蟲［14］中提取獲得，其中家蠶對DNJ有較好的富集作用。Asano等［15］報道，蠶體中DNJ含量是桑葉中的2．7倍。此外，在有關化學合成研究方面，F(xiàn)rommer等［16-17］以芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為初始菌株，通過優(yōu)化發(fā)酵條件獲得富含功能因子DNJ的發(fā)酵液，但該方法由于存在合成路線長、技術要求高、DNJ產量偏低等問題暫無法實現(xiàn)大規(guī)模生產［18］。

2 影響DNJ得率的相關因素

2．1 DNJ的提取 上述影響因素的不同導致桑葉中DNJ含量的差別，因此針對某種桑葉樣品的提取檢測方法具有選擇性和特異性。植物源DNJ的含量偏低，且其他次生代謝干擾物的存在增加了提取技術的難度。目前，這一技術仍在不斷的改進和完善中。

水提取法是提取DNJ的初級方法，簡單且重現(xiàn)性好，但提取液中水溶性雜質較多，分離效果欠佳。酸提取法是目前被廣泛使用的方法，DNJ得率明顯高于水提取法。蔣小飛等［19］采用正交試驗，得出最佳提取工藝為:提取液酸度0．2%，料液比 1∶5，提取時間 1．5 h，但后續(xù)濃縮時相對困難。乙醇的溶解性好，對植物細胞壁的穿透力強，又由于DNJ的分子結構含有4個羥基而具有強極性，常被用來作為提取DNJ的有機溶劑。劉韋鋆等［20］用濃度70%乙醇提取，經一系列吸附、洗脫和純化，獲得的DNJ含量為23．2%，收率為0．355%。

微波和超聲波處理是提取方法中的一種輔助技術，能大幅縮短溶劑提取時間，提高得率，保證物質的結構穩(wěn)定。胡瑞君等［21］研究了微波萃取桑葉中DNJ方法，確定最佳的微波處理時間只需要1．5 min。鄭曉靜等［22］采用響應面法優(yōu)化方法，獲得桑葉DNJ的超聲波提取工藝參數(shù)，實測DNJ得率為0．302 7%。此外，在其他的輔助提取方面，也取得一定進展。孫長波等［23］采用真空氣流細胞破壁技術(VAPB)輔助提取DNJ，其含量比對照桑葉樣品高出74%。谷緒頂?shù)龋?4］用里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌液對桑葉粉發(fā)酵處理12 h，再用稀鹽酸提取DNJ，結果含量比未經發(fā)酵處理組增加了7．14倍，高達 1．995 mg/g。

2．2 DNJ的分離純化 不同來源的DNJ樣品需要選擇最適的分離純化方法進行處理，以降低提取液中蛋白質、淀粉、色素、果膠等雜質的干擾，并且進行下一步的準確檢測分析。

離子交換樹脂層析法是DNJ分離純化中應用較多的方法之一，常用732H型陽離子純化DNJ，用蒸餾水洗去不吸附的雜質，再用氨水或乙醇洗脫，經濃縮后用正丁醇萃取，回收正丁醇，干燥后即得純化的DNJ［25-26］。該方法雖有較好的分離效果，但工藝復雜，作為洗脫劑的氨水因產生刺激性氣味對操作者的健康有一定的危害。大孔吸附樹脂分離法是利用吸附劑的大孔結構從水溶液中吸附有機物達到分離目的，其操作簡單，選擇性好，材料可重復利用，常用于DNJ提取液的脫色除雜。羅蕾蕾等［27］用AB-8大孔吸附樹脂對含DNJ的桑葉提取液進行脫色除雜處理，再用732H型陽離子樹脂層析法進一步純化，得到含量為16．7%的DNJ產品。反相液相色譜法固定相大多為非極性載體，以比固定相極性強的溶劑作為流動相，DNJ為強極性生物堿，故采用此方法可達到純化目的。周惠燕等［28］采用此方法對粗提的DNJ進行純化，得到含量為10．7%的DNJ純化物，證實反相色譜技術分離純化DNJ簡單易行，能夠得到理想的分離效果。膜分離技術富集DNJ的優(yōu)勢明顯，在過程中未使用任何有機溶劑，環(huán)保安全，可作為DNJ生產過程中一項有效的分離富集方法。顏繼忠等［29］用氧化鋁陶瓷膜微濾和聚醚砜膜超濾純化桑葉水提物后，DNJ質量分數(shù)從1．32%提高到7．84%。在實際的分離過程中，膜孔易被堵塞，膜面污染造成膜通量的下降，從而影響DNJ的富集效果。因此，膜本身的穩(wěn)定性改進和膜前處理技術是今后的研究方向。

2．3 DNJ的檢測 選用合適的檢測方法和精準靈敏的檢測儀器對DNJ的最終得率有較大的影響。近些年的DNJ檢測研究大多集中在氣相、液相色譜與質譜的聯(lián)用，并且表現(xiàn)出廣闊的應用前景，但這些設備價格昂貴，實用性不高，因此對檢測器的靈敏性和實用性的兼容方面還需要進一步的改善。以下列舉了目前廣泛使用的或檢測水平較高的幾類方法。

分光光度法常用來進行不同植物成分的含量測定，但DNJ分子結構中不含苯環(huán)、雙鍵和羰基等發(fā)色基團，因此較少用常規(guī)的分光光度法檢測DNJ含量［30］。氣相色譜法分離效率高，選擇性好，樣品用量極少。由于DNJ的沸點較高，必須先將樣品乙?；蚬柰榛煞悬c較低的衍生物才能進行色譜分析，在定性時要聯(lián)用質譜法或光譜法對衍生物目標峰進行確認。王濟強等［31］先將DNJ硅烷衍生化處理后，經過色譜分離、火焰離子化檢測器定量、GC-MS確定目標峰，建立一種簡單、快速、準確測定桑葉中DNJ含量的氣相色譜法。

高效液相色譜法(HPLC)被廣泛應用于DNJ的含量檢測研究中，包括需要柱前衍生化反應和不需要衍生化的HPLC法兩種類型。不需要進行柱前衍生化的方法可直接借助特殊化的檢測器進行測定。宋婕等［32］采用HPLC-ELSD(HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器)法對DNJ含量進行了準確測定，其色譜條件為:TSKgel Am-ide-80色譜柱，以乙腈-水為流動相，柱溫30℃。顏繼忠等［29］根據(jù)DNJ極性較強的特點，選用Aglient ZORBAX NH2色譜柱，以乙腈-水(70∶30)為流動相，建立用于DNJ定量分析的高效液相色譜-示差折光檢測法。姜佳等［33］采用特異性強的高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質譜法(HPLC-MS/MS)，準確分析DNJ的含量。質譜檢測器選用ESI電離源，監(jiān)測的離子對為164．1/110．2，MRM模式，樣品分析時間僅為4 min。這類設備成本高，不易獲得，在應用普及方面還有一定的局限性。柱前衍生-高效液相色譜-熒光檢測法具有靈敏性極高、選擇性強、結果更可靠等優(yōu)點。李繼文［7］以芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)為柱前衍生化試劑進行了衍生條件優(yōu)化，測得DNJ為10～35 mg/L。紫外檢測器與熒光檢測器相比雖然靈敏度有所降低，但更具有實用價值，準確性也可通過調節(jié)試驗條件來完成［34］，是目前測定DNJ含量使用最頻繁、最適用的一種定量分析方法。陳巖等［35］建立了DNJ的高效液相色譜-紫外檢測法，色譜柱為Hypersil C18，流動相為乙腈濃度-濃度0．1%冰醋酸水溶液(50∶50)，流速為 1．0 ml/min，檢測波長為 265 nm，柱溫為 35℃，DNJ的檢測濃度在 5．0 ×10-4～1．0 ×10-3mg/ml范圍內。

3 藥理活性及應用

3．1 降血糖、血脂 DNJ是一種具有類糖結構的生物堿，能高效抑制α-葡糖苷酶的活性，降低人體空腹血糖和餐后血糖峰值的作用顯著。李有貴［36］發(fā)現(xiàn)，桑葉中的DNJ能與α-葡糖苷酶結合，而且其親和性遠大于麥芽糖和蔗糖等二糖有效阻滯二糖的分解，延緩單糖在腸道內的吸收。宮原知江子［37］選用自然發(fā)病的糖尿病大鼠，分3組進行研究，Ⅰ組為對照，Ⅱ組和Ⅲ組分別喂給含2．5%和5%桑葉粉的飼料，到46周齡時所測3組的空腹血糖值分別為18．72、8．53和6．33%mmol/L。Kong等［38］先建立糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)經DNJ治療后的大鼠的空腹血糖水平、糖耐受量和胰島素敏感性都得到顯著改善。Andallu等［39］臨床研究發(fā)現(xiàn)，日服3 g桑葉粉膠囊比服用規(guī)定劑量的降糖藥物格列本脲更能有效降低Ⅱ型糖尿病患者的空腹血糖值，且性質穩(wěn)定，無毒副作用。

DNJ因能影響與脂代謝相關的酶活性而具有降血脂的作用。仝義超［40］通過飼喂高脂飼料建立SD高血脂模型，選用桑葉提取液中不同成分進行灌胃，4周后檢測TC(血清總膽固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)水平，發(fā)現(xiàn)甾醇組、總黃酮組、總生物堿組降血脂動物試驗結果呈陽性，其中總生物堿組效果最佳。

目前，國內多家生物醫(yī)藥公司研發(fā)上市了以DNJ為原料的調節(jié)血糖血脂或減肥新藥，還有幾十家公司專業(yè)生產DNJ提取物。其優(yōu)越的藥理活性在作為降糖降脂食藥成分的產業(yè)化方面前景廣闊。但是，就DNJ對降血糖、血脂的影響來看，大部分學者仍集中在探討其對血糖、各血脂指標、相關酶活的比較，而對其具體的抑制途徑和機理結構未能深入。

3．2 抗腫瘤、病毒 王然君等［41］發(fā)現(xiàn)，DNJ作為天然糖苷酶抑制劑，對小鼠黑色素瘤細胞B16F10的入侵、遷移、黏附有明顯的抑制作用，揭示DNJ可通過抑制MMP-2和MMP-9的活性和表達、上調TIMP-2 mRNA表達以及改變細胞表面糖蛋白水平來降低腫瘤的轉移活性。DNJ還可通過調節(jié)腫瘤細胞表面糖蛋白的修飾、加工過程，抑制其侵襲能力，但其抗腫瘤的分子機制有待進一步研究。

DNJ具有很強的抑制病毒活性的作用，在治療艾滋病和病毒性肝炎方面有一定的開發(fā)潛力。DNJ通過阻礙糖蛋白加工，擾亂gp120的糖基化，可以阻斷或減少HIV誘導的合體細胞形成，中斷HIV的穿透和擴散［42］。此外，謝瓊［43］通過DNJ及其衍生物對體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性研究，發(fā)現(xiàn)DNJ具有較明顯體外抗HBV的作用。

4 展望

基于桑葉中DNJ廣泛的生理活性，國內外已研制出多種預防或治療糖尿病的新藥和相關營養(yǎng)保健食品。它們不僅可有效治療糖尿病及其并發(fā)癥，改善機體的健康狀況，而且毒副作用很低，具有很好的應用前景，但受限于天然DNJ資源的不足，暫不能開展規(guī)模應用。今后，應基于桑葉食藥用途產業(yè)化開發(fā)，綜合考慮資源、成本等要素，在優(yōu)勢桑樹品種篩選、示范以及規(guī)模應用提取工藝、高效純化工藝優(yōu)化和有效提高檢測靈敏度等方面探索成熟路徑;在提高產出手段方面，積極探索桑樹基因組中調控DNJ合成的基因，通過基因工程的方法使其高效表達，從而獲取高含量、高純度DNJ;在活性機理研究方面，應利用代謝組學的特征性評價在分子水平上加深降糖機制研究，特別是桑葉DNJ與其他活性物質的協(xié)同作用研究以及在臨床診斷和治療中的安全性和有效性評價研究?？傊珼NJ在醫(yī)藥、保健食品等領域將擁有無比廣闊的市場潛力和應用前景。

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