黃樟素類化合物分析檢測研究進(jìn)展

李葉青，皮小弟，許洪勇，成 蓮，曾石峭

(1.廣東省河源市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所，廣東河源 517000;2.廣東省河源市食品藥品監(jiān)督檢測所，廣東河源 517000)

黃樟素(safrole)(CAS:94-59-7)又稱黃樟油素、黃樟腦，無色或微黃色液體，不溶于水，易溶于氯仿，乙醚和其他非極性有機(jī)溶劑［1－2］，有樟木氣味，天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫蘇等植物中，是許多食用天然精油如黃樟精油、八角精油和樟腦油的主要成分。由于其舒適的氣味，黃樟油曾經(jīng)在食品、洗滌用品和化妝品中作為調(diào)味劑和調(diào)香劑［3］。

黃樟素類化合物主要包括黃樟素、異黃樟素和二氫黃樟素等。黃樟素用來合成胡椒基丁醚和胡椒醛，胡椒基丁醚是農(nóng)藥的增效劑，胡椒醛用來調(diào)味，是香料的組分［4－5］。黃樟素也是非法生產(chǎn)毒品——搖頭丸的一個重要組成部分［6］。異黃樟素和二氫黃樟素是黃樟素的衍生物，異黃樟素是黃樟素在氫氧化鉀－無水乙醇溶液中加熱異構(gòu)化的產(chǎn)物，有類似茉莉醛的氣息，香氣強(qiáng)烈而持久;二氫黃樟素由黃樟素氫化而得，是合成農(nóng)藥增效醚的重要中間體，具有黃樟素類似的香氣。

許多常見的香料，包括黑胡椒、可可、肉豆蔻、肉桂、龍蒿、八角、茴香、香菜、西芹、月桂、小茴香、香果和丁香都含有微量的黃樟素［7－8］。使用上述香料的軟飲料中黃樟素的檢出限為3～5 mg/L，可口可樂和百事可樂也包含其中［9］;酒精飲料含有0.15 ～3.00 mg/L［10］。

試驗表明，黃樟素對老鼠有致肝腫瘤的效果。1960年12月3日，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)禁止食品中有黃樟素、黃樟油、異黃樟素和二氫黃樟素的存在［11］。2001年，歐盟委員會規(guī)定黃樟素和異黃樟素的總使用限量，食品和飲料中為1 mg/kg，含酒精飲料為5 mg/kg(酒精含量大于25%);含肉豆蔻食品為 15 mg/kg［3，12－13］。2005 年，歐洲委員會將黃樟素列為懷疑弱致癌物質(zhì)，雖然沒有規(guī)定每日限量，但要求設(shè)置的盡可能低，目前正在由歐洲委員會評估［14］。黃樟素的允許攝入量，歐盟委員會估計為0.3 mg/d，或成人以60 kg體重計0.005 mg/kg［12］;世界衛(wèi)生組織估計美國人為 4 ～569 μg/d，歐洲人0.6 ～879.0 μg/d［15］。黃樟素 TD50為51 mg/kg［16］。

我國于2005年實施的《易制毒化學(xué)品管理條例》將黃樟素列為第一類易制毒化學(xué)品。由于黃樟素類化合物的毒副作用，建立準(zhǔn)確、快速、簡便的黃樟素類化合物分析檢測方法，對于評估食品、化妝品及煙草的安全性有著重要作用。目前，常用檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、氣相色譜法(GC)和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)等，筆者簡要概括了近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的黃樟素類化合物分析檢測方法。

1 氣相色譜與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

直接用氣相色譜－火焰離子化檢測器(GC-FID)定量或用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)定性定量檢測是目前測定黃樟素類化合物的主要方法。

2001年，Choong等采用GC-FID分析了軟飲料中的黃樟素和異黃樟素［9］。樣品未經(jīng)處理直接進(jìn)樣，以1，4-二羥基苯(DHB)為內(nèi)標(biāo)定量，檢出限為0.25 μg/ml。分析的25種軟飲料中有20種檢出目標(biāo)物。

吳婷等為了同時分析吐司面包、番茄醬、廣式香腸、可樂、葡萄酒中的黃樟素等多種成分，采用同時蒸餾萃取方法以二氯甲烷為提取劑將待測物從食品基質(zhì)中分離出來，用1，4-二溴苯和乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)定量［17］。GC-FID測定黃樟素的方法檢出限為0.2 μg/ml。待測物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值與濃度比值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 54～0.999 73，空白加標(biāo)回收率為 82.147% ～98.106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.109% ～4.105%，通過對市場上5種食品的檢測，表明該法可實現(xiàn)對樣品進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確的定性定量分析。

王星等建立用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測定化妝品中黃樟素、6-甲基香豆素的方法［18］。方法樣品用甲醇提取，超聲后定容，脫水，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，用GC-MS法定性，外標(biāo)法定量。該方法條件下，黃樟素的加標(biāo)回收率為101.3%～106.0%，RSD 為0.9% ～1.4%，測定限(以S/N=10 計)為 5 μg/g。

周貽兵等將煙用香精樣品以甲醇超聲提取，提取液經(jīng)高速離心、0.45 μm 濾膜過濾后，供氣相色譜測定［19］。采用SE-54毛細(xì)管柱分離樣品，經(jīng)FID檢測，外標(biāo)法定量。黃樟素的質(zhì)量濃度在1.0～50.0 mg/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈線性關(guān)系，方法的檢出限(3S/N)為0.3 mg/L。黃樟素加標(biāo)回收率在88.0% ～94.7%，RSD(n=6)在 0.8% ～4.5%。

李長于等采用乙醇超聲提取，丙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，氣相色譜－離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法測定香精香料中黃樟素的含量［20］。選取黃樟素的母離子和子離子分別為m/z 162和m/z 131，內(nèi)標(biāo)丙酸苯乙酯選擇m/z 104為定量離子。結(jié)果表明，黃樟素在0.05～5.00 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r＞0.995)，方法的檢測限(S/N=3)黃樟素為 0.002 mg/L，加標(biāo)回收率為90.0% ～131.2%。

MAHESH·PAL等將肉豆蔻果實通過水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油通過GC和GC-MS進(jìn)行分析［21］。代表該精油的95.9%的28種成分被確認(rèn):黃樟素含量為3.4%。

Queila P.S.Barbosa等對一種胡椒科植物的黃樟素含量通過GC-MS和GC-FID進(jìn)行分析［22］。該組織葉、果實、莖的黃樟素含量分別為2.0%、4.8%和1.7%。GC檢測條件為:DB-5 石英毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm i.d.×0.25 μm)，起始柱溫60℃，3℃/min升到240℃。

2 液相色譜與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

近年來，由于帶有二極管陣列檢測器(DAD)的液相色譜儀具有的定性定量檢測的能力，使用DAD-LC檢測黃樟素含量的報道較多，而LC-MS/MS比普通的LC有更高的分析選擇性和靈敏度，越來越多的研究采用LC-MS/MS來分析復(fù)雜食品基體中的黃樟素。

王海利等建立了利用超高效液相色譜儀檢測天然提取物中黃樟素含量的方法［23］。以無水乙醇為溶劑，振蕩萃取黃樟素后，直接進(jìn)樣。經(jīng)配置FLRD檢測器的超高效液相色譜于激發(fā)波長288 nm、發(fā)射波長325 nm下對其進(jìn)行檢測。所得回歸方程為:Y=5.51×106X+3.48×105，(R2=0.998 6，n=5)，平均回收率為95.1%，檢測限為 38.3 ng/g。

Kurt A.Reynertson等建立了高效液相色譜定量檢測一種香樟樹皮中黃樟素的方法［24］，235 nm PDA檢測，黃樟素標(biāo)準(zhǔn)物出峰時間約在20 min，回歸曲線R2=0.999 9。該植物材料的甲醇提取物中黃樟素的含量為0.435%(W/W)(±5×10－6)，方法檢測限定量限分別為1.25 μg/ml和3.75 μg/ml。

Chu Chen等建立了高效液相色譜法測定某些藥材中的黃樟素和甲基丁香酚的含量［25］，Nucleosil 100-5 C18色譜柱(5 μm，250 mm ×4.0 mm i.d.)，外加保護(hù)柱(5 μm，8 mm ×4.0 mm i.d.);流動相為甲醇、四氫呋喃和水(52∶8∶40);流速為1.0 ml/min;檢測波長為286 nm。分析表明，黃樟素在測試的干草藥的含量范圍為0.14～2.78 mg/g。

Kate Cummings建立了超快速液相色譜(UFLC)檢測黃樟素的方法［26］。色譜條件為:YMC ODS-AQ S-8反相C18色譜柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.);流動相:(溶劑 A)蒸餾水，(溶劑B)乙腈。HPLC的條件如下:0～5 min(B)5%，5～10 min(B)15%，10～45 min(B)100%，保留10 min;進(jìn)樣量為10 μl;235 nmUV檢測。黃樟素保留時間為(37.77±0.23)min，LOD 和LOQ 分別為1.514 mg/kg 和2.049 mg/kg。

3 我國現(xiàn)行檢測分析標(biāo)準(zhǔn)

近年來，我國相繼制定了一系列黃樟素的分析檢測國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)。標(biāo)準(zhǔn)方法中氣相色譜是主要的檢測手段。GB/T 14454.15－2008《黃樟油 黃樟素和異黃樟素含量的測定填充柱氣相色譜法》以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，以GC-FID分析黃樟油中黃樟素和異黃樟素。SN/T 1783－2006《進(jìn)出口化妝品中黃樟素和6-甲基香豆素的測定氣相色譜法》中方法——采用甲醇超聲提取化妝品中的黃樟素和6-甲基香豆素，GC-FID測定并以GC/MS確證。

4 結(jié)語

綜上所述，黃樟素檢測方法的研究開展的不算晚，主要集中在香精、香料及煙草中的研究。測定黃樟素類化合物的國家標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)還不多，并且這些標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)中多數(shù)只規(guī)定了1～2種物質(zhì)的分析方法，相關(guān)文獻(xiàn)報道的檢測方法也大多是檢測1～2種黃樟素類物質(zhì)，而隨著其他化合物的毒理學(xué)信息的報道及添加限量的控制，同時檢測多種黃樟素類物質(zhì)及其他化合物的分析標(biāo)準(zhǔn)可能將是今后制定標(biāo)準(zhǔn)的方向。

食品中黃樟素類化合物的檢測還未見有標(biāo)準(zhǔn)方法的建立，目前，僅有試驗研究報道采用液相萃取與色譜分離結(jié)合的方法分析食品中的黃樟素。黃樟素類化合物可用作天然除蟲菊酯農(nóng)藥增效劑，隨著除蟲菊酯類農(nóng)藥的大量使用，必將造成它在食品特別是茶葉中的殘留;黃樟素也曾是很多食品的添加劑，如用于飲料，但因其對人毒害較大，已禁止作為食品添加劑使用。食品中禁用物質(zhì)的檢測，準(zhǔn)確定性至關(guān)重要，新技術(shù)、新方法的研究仍十分重要，相信食品中黃樟素類化合物的分析檢測必將朝著準(zhǔn)確化、快速化及多元化的方向發(fā)展。

［1］WINDHOLZ M，BUDAVARI S，STROUMTSOS L Y，et al.The merck index:An encyclopedia of chemicals，drugs and biologicals［M］.Rahway，NJ.USA:Merck ＆ Co.Inc，1989.

［2］BURDOCK G A.Encyclopedia of food and color additives［M］.Florida:CRC Press，1997.

［3］CARLSON M R，THOMPSON D.Liquid chromatographic determination of safrole in sassafras-derived herbal products［J］.Journal of AOAC international，1997，80(5):1023 －1028.

［4］MIGLIERINI G.Sassafras oil，a key raw material now largely banned from the market［J］.Chemistry today，2008，26(5):59 －62.

［5］OLTRAMARI A C，WOOD K V，BONHAM C，et al.Safrole analysis by GC-MS of prototrophic(Ocotea odorifera(Vell.)Rohwer)cell cultures［J］.Plant cell，tissue，and organ culture，2004，78(3):231 －235.

［6］RATSCH C.The encyclopedia of psychoactive plants［M］.Vermont:Parkstreet Press，1998.

［7］CFR，Sec.189:Code of Federal Regulations［S］.2011.

［8］SCF.Scientific Committee on Food，European Commission:Opinion of the Scientific Committee on Food on the safety of the presence of safrole(1-allyl-3，4-methylene dioxy benzene)in flavourings and other food ingredients with flavouring properties［S］.2002.

［9］SCF.Scientific Committee on Food，European Commission:Opinion of the Scientific Committee on Food on Isosafrole［S］.2003.

［10］CD-P-SP.Council of Experts on Flavouring Substances(P-SP-AR)［C］//53rd Meeting.Strasbourg，2005:12 －14 .

［11］WHO.World Health Organization:WHO Food Additives Series:60.Safety evaluation of certain food additives.The 69th Meeting of Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives［S］.2009.

［12］HERP.Ranking Possible Cancer Hazards from Rodent Carcinogens，Using the Human Exposure/Rodent Potency Index(HERP)［S］.2011.

［13］HEIKES D L.SFE with GC and MS determination of safrole and related allylbenzenes in sassafras teas［J］.Journal of chromatographic science，1994，32(7):253 －258.

［14］ZHOU G D，MOORTHY B，BI J，et al.DNA adducts from alkoxyallylbenzene herb and spice constituents in cultured human(HepG2)cells［J］.Environmental and molecular mutagenesis，2007，48(9):715 －721.

［15］CHOONG Y M，LIN H J.A rapid and simple gas chromatographic method for direct determination of safrole in soft drinks［J］.Journal of food and drug analysis，2001，9(1):27 －32.

［16］CURRó P，MICALI G，LANUZZA F.Determination of β-asarone，safrole，isosafrole，and anethole in alchoholic drinks by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of chromotography，1987，404:273 －278.

［17］吳婷，金其璋.不同食品中側(cè)柏酮、龍蒿腦、黃樟素和甲基丁香酚的含量測定［J］.中國食品添加劑，2010(1):223－228.

［18］王星，蔡天培，王超，等.化妝品中黃樟素和6-甲基香豆素的氣相色譜－質(zhì)譜測定法［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，24(5):358 －359.

［19］周貽兵，滕明德，張明時.毛細(xì)管柱氣相色譜法測定煙用香精中黃樟素和香豆素［J］.理化檢驗 －化學(xué)分冊，2011，47(1):39 －43.

［20］李長于，李祖光，周示玉，等.氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定香精香料中的香豆素和黃樟素［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2011，32(5):265 －270.

［21］MAHESH P，RAJESH KUMAR V.Anti-termite activity of essential oil and its components from Myristica fragrans against Microcerotermes beesoni［J］.Journal of applied sciences and environmental management，2011，15(3):559－561.

［22］BARBOSA Q P S，DA C?MARA C A G，RAMOS C S，et al.Chemical composition，circadian rhythm and antibacterial activity of essential oils ofPiper divaricatum:A new source of safrole［J］.Quim nova，2012，35(9):1806 －1808.

［23］王海利，孟昭宇，湯建國，等.超高效液相色譜法測定天然提取物中的黃樟素［J］.香料香精化妝品，2009(6):11－13.

［24］REYNERTSON K A，BALICK M J，LEE R，et al.A traditional method of Cinnamomum carolinense preparation eliminates safrole from a therapeutic Pohnpean tea［J］.Journal of ethnopharmacology，2005，102:269 －274.

［25］CHEN C，SPRIANO D，LEHMANN T.Reduction of safrole and methyleugenol in Asari radix et rhizoma by decoction［J］.Forsch komplementmed，2009，16(3):162 －166 .

［26］CUMMINGS K.Sassafras tea:Using a traditional method of preparation to reduce the carcinogenic compound safrole［D］.South Carolina Clemson City，United States，Clemson University，2012.